楊雪峰，張海棠，陳洪雨，劉醒醒，戴茜茜，張 方，葛亞明，王自良

(河南科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鎘(Cadmium，Cd)是一種有毒的重金屬元素，由于其多年來在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用而成為一種極為普遍的重要環(huán)境污染物。鎘對人體的多種組織、器官和系統(tǒng)均能產(chǎn)生毒性，并可引起多種細(xì)胞的DNA 損傷[1-3]，從而危害人類健康。震驚世界的“痛痛病”(Itai-itai disease)就是由于日本當(dāng)?shù)厝巳洪L期攝入鎘廢水污染的稻米及蔬菜而引起的一種慢性鎘中毒疾病。資料表明，鎘具有致畸、致癌、致突變作用[4]。國際癌癥研究組織將鎘列為人類 Ⅰ 類致癌物[5]。

鎘具有免疫毒性，脾是其主要靶器官之一。大量資料表明，鎘主要引起胸腺萎縮和脾腫大，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，損傷機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而抑制機(jī)體的免疫功能[6-8]。處在生長發(fā)育階段的人群可能較成年人對鎘的毒性更敏感，但目前關(guān)于鎘對此階段機(jī)體免疫毒性作用機(jī)制的研究極少。本試驗?zāi)M自然環(huán)境中人體暴露鎘的情況，以生長期小鼠為模型動物，研究了飲水染鎘對小鼠脾臟組織及脾細(xì)胞DNA的損傷作用，以期為揭示鎘對生長期人群的免疫毒性作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 (20±1) d斷乳的健康昆明小鼠40只，雌雄各半，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要儀器 全自動血液分析儀、DU 800紫外分光光度計、Leica輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Axiostar plus顯微鏡及其照相系統(tǒng)、電泳儀、電子分析天平、熒光顯微鏡及數(shù)碼拍照系統(tǒng)、磨砂載玻片、磁力攪拌器等。

1.1.3 主要試劑 氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，分析純，上海亭新化工試劑廠，批號20080901，使用時用去離子水配制成不同濃度。低熔點瓊脂糖(LMA，Invitrogen分裝，批號99710220)，N-十二烷基肌氨酸鈉(Sigma分裝，批號89110150)，Triton-X-100(Genview分裝，批號98410250)，溴化乙錠(EB，Sigma分裝，批號yy 051313208)，正常熔點瓊脂糖(NMA，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 試驗分組 由急性毒性試驗得出[9]，小鼠氯化鎘經(jīng)口灌胃的半數(shù)致死劑量(LD50)為187 mg/kg。

將斷乳小鼠適應(yīng)環(huán)境至(25±1) d時稱體質(zhì)量后，隨機(jī)分為對照組、鎘低劑量組(LD50/100)、鎘中劑量組(LD50/50)和鎘高劑量組(LD50/25)，每組10只，雌雄各半，按性別于室溫下分籠飼養(yǎng)，各試驗組小鼠每天按染鎘劑量自由飲水。

1.2.2 染毒時間 小鼠染毒時間為40 d。為保證小鼠的染鎘劑量，根據(jù)各試驗組小鼠前5 d的平均體質(zhì)量和平均自由飲水量配制隨后5 d的氯化鎘溶液濃度，即采用每5 d稱一次體質(zhì)量和量一次飲水量的方法來計算隨后5 d的飲水鎘溶液的濃度，然后將氯化鎘用去離子水配制成不同濃度的溶液，供各試驗組小鼠通過自由飲水方法全部飲完，以對小鼠進(jìn)行鎘暴露染毒處理，并確保各試驗組的染鎘劑量。對照組小鼠自由飲用去離子水。

1.2.3 脾臟相關(guān)參數(shù)的計算 小鼠染毒結(jié)束時，先稱體質(zhì)量，然后采用頸椎脫臼法處死，并小心取出脾臟和腦組織分別稱質(zhì)量，以脾臟質(zhì)量(mg)/腦質(zhì)量(mg)表示脾腦系數(shù)[10-11]，以脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)表示脾臟指數(shù)。

1.2.4 血液免疫指標(biāo)的測定 采用摘眼球法收集小鼠血液，一部分置于抗凝管中混勻，利用全自動血液分析儀測定小鼠的白細(xì)胞 (White blood cells，WBC)總數(shù)、淋巴細(xì)胞(Lymphocyte，LY)比率(%)、中值細(xì)胞(Medina cells，MO)比率(%) 和中性粒細(xì)胞(Neutrophil granulocyte，GR)比率(%)；另一部分血液自然凝固后4 000 r/min離心20 min，利用紫外分光光度計測定血清免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的質(zhì)量濃度(g/L)。

1.2.5 脾臟組織病理學(xué)檢查 將稱質(zhì)量后的部分小鼠脾臟組織用體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液固定，然后按常規(guī)方法脫水、包埋、切片、HE 染色，制備組織切片，并利用光學(xué)顯微鏡檢查脾臟組織的病理學(xué)變化。

1.2.6 彗星試驗(Comet assay) 彗星試驗又叫單細(xì)胞凝膠電泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)試驗。分別將每組處死的6只小鼠(雌雄各半)的脾臟組織立即制備成單細(xì)胞懸液，參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行彗星試驗，EB染色后的載玻片樣本盡快在熒光顯微鏡下觀察并拍照。① 每只小鼠的脾臟組織制備1張片子，每張片子隨機(jī)選擇100個脾細(xì)胞，計算各組小鼠脾細(xì)胞的拖尾率。② 每張脾臟組織片子隨機(jī)選擇25個細(xì)胞，利用Comet Assay Software Pect(CASP 1.2.3 beta 1)軟件進(jìn)行彗星參數(shù)測定，參數(shù)包括尾長(Tail length，TL，單位：pixel)、彗星全長(Comet length，CL，單位：pixel)、尾矩(Tail moment，TM，單位：arbitrary units)和Olive 尾矩(Olive tail moment，OTM，單位：arbitrary units)。③ 根據(jù)各彗星尾部DNA含量，將脾細(xì)胞DNA 損傷等級分成5級[13]。0 級：彗星尾部DNA含量<5%，細(xì)胞無損傷；1 級：5%≤彗星尾部DNA含量<20%，低度損傷；2 級：20%≤彗星尾部DNA含量<40%，中度損傷；3 級：40%≤彗星尾部DNA含量≤95%；4 級：彗星尾部DNA含量>95%，重度損傷。計算每種損傷等級的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對小鼠脾臟相關(guān)參數(shù)的影響

由表1可知，試驗結(jié)束時，小鼠終末體質(zhì)量隨染鎘劑量的增加而降低，鎘高劑量組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；各組間的腦質(zhì)量無顯著差異；脾臟質(zhì)量、脾腦系數(shù)、脾臟指數(shù)均隨染鎘劑量的增加而增大，但各組間的脾臟質(zhì)量和脾腦系數(shù)均差異不顯著(P>0.05)，而鎘高劑量組的脾臟指數(shù)與對照組差異極顯著(P<0.01)，與鎘低劑量組差異顯著(P<0.05)，與鎘中劑量組差異不顯著(P>0.05)。

表 1 鎘對小鼠脾臟相關(guān)參數(shù)的影響(n=10)

2.2 鎘對小鼠血液免疫指標(biāo)的影響

由表2可知，隨著染鎘劑量的增加，小鼠白細(xì)胞總數(shù)升高，鎘高劑量組與對照組間差異極顯著(P<0.01)，與鎘低劑量組間差異顯著(P<0.05)；淋巴細(xì)胞比率有升高趨勢，但各組間差異不顯著(P>0.05)；中性粒細(xì)胞比率基本無變化；中值細(xì)胞比率、IgG和IgM降低，鎘高劑量組與對照組間相比，均差異極顯著(P<0.01)。

表 2 鎘對小鼠血液免疫指標(biāo)的影響(n=10)

2.3 鎘對小鼠脾臟組織的病理學(xué)影響

對照組小鼠脾臟組織的紅髓、白髓界限清晰，白髓內(nèi)的淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)完整，生發(fā)中心明顯(圖1-A)；鎘低劑量組小鼠白髓區(qū)淋巴細(xì)胞減少(圖1-B)；鎘中劑量組小鼠白髓區(qū)淋巴細(xì)胞減少，紅髓內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增加(圖1-C)；鎘高劑量組小鼠白髓區(qū)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，紅髓內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖1-D)，其他未見異常變化。

圖 1 鎘對小鼠脾臟組織的病理學(xué)影響(400×)

2.4 鎘對小鼠脾細(xì)胞DNA拖尾率的影響

由圖2可知，小鼠脾細(xì)胞DNA的拖尾率隨染鎘劑量的增加而增大。各劑量組與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)，而且各劑量組之間比較，也均表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)。

圖 2 鎘對小鼠脾細(xì)胞DNA拖尾率的影響

2.5 鎘對小鼠脾細(xì)胞DNA彗星參數(shù)的影響

由表3可知，各劑量組脾細(xì)胞DNA 的TL、CL、TM和OTM均較對照組高。與對照組比較，鎘低劑量組CL差異顯著(P<0.05)，其他參數(shù)均差異不顯著(P>0.05)；鎘高、中劑量組的各參數(shù)均與對照差異極顯著(P<0.01)。鎘高劑量組與鎘中、低劑量組相比，各參數(shù)均差異極顯著(P<0.01)；鎘中劑量組與鎘低劑量組相比較，TL差異顯著(P<0.05)，CL差異不顯著(P>0.05)，TM和OTM均差異極顯著(P<0.01)。

2.6 鎘對小鼠脾細(xì)胞DNA損傷等級的影響

在熒光顯微鏡下觀察可知，對照組小鼠脾細(xì)胞DNA大小比較均勻，呈大而亮的圓形熒光團(tuán)，絕大多數(shù)沒有拖尾，DNA損傷為0級(圖3-A)，但不同劑量鎘致脾細(xì)胞DNA出現(xiàn)了不同程度的拖尾現(xiàn)象(圖3-B和圖3-C)。

各組脾細(xì)胞DNA損傷分級結(jié)果見表4。由表4可知，小鼠脾細(xì)胞DNA在正常情況下也有損傷，但較輕微；不同劑量的鎘均能導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞DNA損傷，并呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，以鎘高劑量組損傷最嚴(yán)重。鎘低劑量組中，損傷等級≥2級的細(xì)胞比率為9.3%，其中3級占1.3%，4級為0；鎘高劑量組中，損傷等級≥2級的細(xì)胞比率高達(dá)70.0%，其中3級損傷細(xì)胞占36.7%，4級損傷細(xì)胞占4.0%。

表 3 鎘對小鼠脾細(xì)胞DNA彗星參數(shù)的影響

圖 3 鎘對小鼠脾細(xì)胞DNA影響的彗星試驗電泳照片(200×)

表 4 鎘致小鼠脾細(xì)胞DNA損傷的分級結(jié)果

3 討 論

3.1 鎘暴露途徑

暴露途徑是化學(xué)毒物發(fā)揮毒性作用的一個主要因素[14]，鎘進(jìn)入動物體內(nèi)被吸收的量依賴于其暴露途徑。對于非職業(yè)性暴露和不吸煙的人群來說，經(jīng)由各種途徑經(jīng)口攝入體內(nèi)是鎘進(jìn)入人體的最主要途徑。但人們在研究鎘的毒性及其機(jī)理時，所用的染鎘途徑大多數(shù)是皮下注射或腹腔注射[1-2]，這與自然條件下機(jī)體鎘暴露的途徑是不一致的。本試驗?zāi)M自然環(huán)境中人體暴露鎘的情況，通過飲水途徑染鎘，建立了自然條件下鎘暴露的動物模型，研究結(jié)果更具理論參考價值。

3.2 染鎘時期

小鼠斷乳(約20 d)至性成熟前(60～65 d)是其個體生長周期中的重要時期。在此階段，機(jī)體各部分的生長發(fā)育均較旺盛，并日趨成熟，外界環(huán)境中的各種有害因素可能會影響其某些組織器官的發(fā)育成熟和生理功能。以往對鎘毒性的研究主要是利用發(fā)育成熟的成年動物，而對處于生長階段的動物研究較少。本試驗以斷乳小鼠為模型動物，染鎘時間40 d，相當(dāng)于其整個生長發(fā)育階段。試驗結(jié)果表明，與對照組比較，鎘低劑量組小鼠的脾臟組織出現(xiàn)白髓區(qū)淋巴細(xì)胞減少現(xiàn)象，脾細(xì)胞DNA拖尾明顯(P<0.01)，CL差異顯著(P<0.05)，3級損傷細(xì)胞為1.3%，說明即使是低劑量暴露鎘，對生長發(fā)育期的小鼠也會產(chǎn)生免疫毒性。其原因可能主要是由于處在生長發(fā)育階段小鼠的脾臟對鎘比較敏感所致；另一方面，眾所周知，鎘是一種易于蓄積的有毒重金屬，由于其在人體內(nèi)的低排泄率使其生物半衰期較長(15～30年)。因此，即使是低劑量，長期暴露后蓄積的鎘也會對生長發(fā)育期機(jī)體的免疫器官及其功能產(chǎn)生不良影響。

3.3 脾腦系數(shù)和脾臟指數(shù)

大量資料表明，當(dāng)動物體質(zhì)量變化較大時，采用臟腦系數(shù)比臟器指數(shù)更有助于對藥物毒性效應(yīng)作出正確評價[10-11,15]。在長期毒性試驗中，毒物可能是影響機(jī)體營養(yǎng)吸收的重要因素，致使體質(zhì)量和臟器系數(shù)均出現(xiàn)較大波動，但腦質(zhì)量的變化受毒物或藥物的影響作用相對較小，故腦質(zhì)量可以作為動物較為恒定的基準(zhǔn)質(zhì)量，因而臟腦系數(shù)可以較為準(zhǔn)確地反映某一臟器的相對質(zhì)量變化。此外，絕大部分臟器質(zhì)量隨動物體質(zhì)量的增加而增加，但腦的絕對質(zhì)量幾乎不隨動物年齡的增加而發(fā)生變化[15]。因此，臟腦系數(shù)的波動主要反映臟器本身的變化。當(dāng)動物體質(zhì)量發(fā)生明顯變化時，臟腦系數(shù)對于平衡體質(zhì)量的變異尤為重要[10]。雖然臟器系數(shù)是毒理學(xué)試驗中常用的指標(biāo)，但其局限性在于統(tǒng)計檢驗的陽性結(jié)果有時可能并不反映臟器的質(zhì)量變化。如當(dāng)動物體質(zhì)量變化的幅度比多數(shù)臟器質(zhì)量變化的幅度大時，在對照組與毒物或藥物試驗組之間出現(xiàn)的顯著性差異是給藥組動物體質(zhì)量明顯下降所造成的，本試驗結(jié)果即說明了此點。本試驗中，與對照組相比，隨著染鎘劑量的增加，小鼠終末體質(zhì)量降低，鎘高劑量組差異顯著(P<0.05)；脾臟指數(shù)升高，鎘高劑量組與對照組間差異極顯著(P<0.01)，與脾臟質(zhì)量增加(P>0.05)不一致。試驗各組間的腦質(zhì)量基本無變化，脾腦系數(shù)隨染鎘劑量增加呈增大趨勢(P>0.05)，說明鎘可致脾質(zhì)量增加，會誘發(fā)小鼠脾臟腫大，這與剖檢取樣時觀察到的現(xiàn)象一致。

3.4 鎘對小鼠血液免疫指標(biāo)和脾臟組織形態(tài)學(xué)的影響

作為體內(nèi)最大的外周免疫器官，脾臟是產(chǎn)生抗體并進(jìn)行免疫應(yīng)答的主要場所。本試驗中，白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞比率升高，中值細(xì)胞比率、IgG和IgM降低，且鎘高劑量組與對照組間均差異極顯著(P<0.01)，表明高劑量的鎘對免疫系統(tǒng)有顯著影響，可引起機(jī)體的免疫功能下降。進(jìn)一步的組織切片檢查發(fā)現(xiàn)，低劑量(LD50/100)以上的氯化鎘可致生長發(fā)育階段小鼠脾臟組織出現(xiàn)病理學(xué)變化，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示鎘致脾組織形態(tài)學(xué)的改變可能是鎘免疫毒性的一個重要機(jī)制。有資料表明，高鎘可造成脾臟實質(zhì)細(xì)胞變性、壞死，使其對提呈的抗原應(yīng)答失敗，抗體分泌減少，導(dǎo)致機(jī)體的體液免疫功能下降或缺陷[16]。

3.5 鎘對生長期小鼠脾細(xì)胞DNA損傷的影響

盡管已知脾是鎘免疫毒性作用的一個靶器官，但鎘致免疫毒性的機(jī)制目前尚不十分清楚。盧次勇等[17]對大鼠經(jīng)口灌胃連續(xù)染鎘3周，發(fā)現(xiàn)隨著鎘劑量的升高，鎘致脾淋巴細(xì)胞DNA損傷和淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化功能降低均有進(jìn)一步加重趨勢，二者呈正相關(guān)，提示鎘的免疫毒性機(jī)理可能與其導(dǎo)致的免疫細(xì)胞DNA損傷有密切關(guān)系。姜聲揚等[18]研究表明，小鼠體內(nèi)染鎘10 d，鎘能抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，盡管鎘低劑量組脾細(xì)胞DNA的TL、TM和OTM指標(biāo)均差異不顯著(P>0.05)，但拖尾率差異極顯著(P<0.01)，3級損傷脾細(xì)胞數(shù)是對照組的2倍，說明低劑量暴露鎘對生長發(fā)育期小鼠脾細(xì)胞DNA也具有一定的毒性作用；生長期小鼠脾細(xì)胞DNA損傷隨染鎘劑量的增加而加重，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。上述結(jié)果提示，鎘致脾細(xì)胞DNA損傷可能是鎘免疫毒性的另一重要機(jī)制，但其與脾組織形態(tài)學(xué)改變的關(guān)系還有待于更深入研究。

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