余祖華,滕 蔓,丁 軻,閔亞杰,禹樂樂，宿靖?jìng)?，程相朝，羅 俊

(1 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003；2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002；3 洛陽(yáng)普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471003)

馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)是一種能引起其自然宿主發(fā)生腫瘤的致瘤性皰疹病毒[1]，屬于α皰疹病毒[2]，具有高度的接觸傳染性。MDV感染雞后能引起馬立克氏病(Marek’s disease,MD)，該病首次由Joszef Marek于1907年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[3]，是一種主要以淋巴組織增生性紊亂、神經(jīng)性、免疫抑制性為主要特征的疾病。MDV共有3種血清型[2]，即MDV-1(Gallid herpesvirus 2，GaHV2)、MDV-2(Gallid herpesvirus 3，GaHV3)和MDV-3(Meleagrid herpesvirus 1，MeHV1)，其中GaHV2包括對(duì)宿主具有毒力或致瘤性的強(qiáng)毒分離株及其致弱變異株；GaHV3沒有致病性；MeHV主要是火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkeys，HVT)，也沒有致病性，且可用于制備疫苗來預(yù)防MD。根據(jù)GaHV2毒株致病性的不同，可將MDV-1分為溫和毒株(Mild MDV，mMDV)、強(qiáng)毒MDV(Virulent MDV，vMDV)、超強(qiáng)毒MDV(Very virulent MDV，vvMDV)以及特超強(qiáng)毒MDV(Very virulent plus MDV，vv+MDV)[4]。Meq基因是GaHV2毒株特有的基因，為MDV的致瘤基因，其N末端具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(Basic region leucine zipper，bZIP)，C末端具有富含脯氨酸重復(fù)區(qū)(Proline-rich repeats，PRRs)的轉(zhuǎn)錄激活域[5-6]。迄今為止，MD的預(yù)防與控制仍需通過疫苗免疫來進(jìn)行。但是，隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的不斷擴(kuò)大，MDV對(duì)常規(guī)疫苗的抵抗力也在逐漸增加，且能突破MDV疫苗的免疫保護(hù)，因此在疫苗免疫雞群中常發(fā)生野毒株的感染，且致病力也呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。2011-2012年，河南省某些疫苗免疫雞群發(fā)生較大規(guī)模的MD流行[7]，筆者對(duì)病例雞進(jìn)行了病毒分離，為了解這些分離株Meq基因的分子特性，本研究對(duì)17個(gè)MDV分離株的Meq基因進(jìn)行了克隆測(cè)序，并將其與4種致病型MDV-1參考毒株進(jìn)行了比較分析，旨在了解這些分離株的遺傳變異特征及可能的致病性。

1 材料與方法

1.1 MDV毒株

17個(gè)MDV分離株分別為HNGS101、HNGS201、HNGS206、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC107、HNLC202、HNLC203、HNLC401、HNLC502、HNLC503、HNLH302、HNLH303、HNLH304、 HNLH305和HNSC105，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。MDV GX0101株為分離于中國(guó)廣西產(chǎn)蛋雞群的1株GaHV2野毒株，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試驗(yàn)材料

Premix Ex TaqTM、pMD19-T載體、E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.3 參考毒株的Meq基因序列

4種不同致病性MDV-1Meq基因序列來自GenBank，其毒株及序列號(hào)分別為：mMDV CVI988(AF493555)和中國(guó)疫苗株814(AF493551)、vMDV GA(AF147806)、vvMDV RB1B(AY243332)、vv+MDV毒株648A(AY362725)。

1.4 分離株Meq基因的擴(kuò)增

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中發(fā)表的 MDV Md5株的全基因序列 (No.AF243438)，應(yīng)用Primer primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增Meq基因全序列的引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 020 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

上游引物P1:5′-ATGTCTCAGGAGCCAGAG-3′(位于基因組134 867-134 884堿基處)；

下游引物P2:5′-TCAGGGTCTCCCGTCACC-3′(位于基因組135 869-135 886堿基處) 。

1.4.2Meq基因的PCR擴(kuò)增 用DNA提取試劑盒提取各MDV分離株感染的雞胚成纖維(Chicken embryo fibroblast,CEF)細(xì)胞總DNA，用去離子水調(diào)整DNA至質(zhì)量濃度為100 ng/μL后，進(jìn)行各分離株Meq基因的PCR擴(kuò)增。同時(shí)以MDV GX0101株感染CEF細(xì)胞的總DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以CEF細(xì)胞總DNA為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括ExTaq酶10 μL，10 pmoL/μL的上、下游引物各l μL，DNA模板1 μL，去離子水7 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，60 ℃ 復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min, 共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。置于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳條帶大小。

1.5 Meq基因的克隆與測(cè)序

用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將其與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取在具有氨芐抗性的LB固體平板上生長(zhǎng)的單克隆菌落，接種至具有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)10～12 h，然后進(jìn)行菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。PCR鑒定陽(yáng)性菌送樣至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 Meq核苷酸及其編碼氨基酸的序列分析

分別用DNAStar MegAlign軟件和MEGA 4.0軟件對(duì)各分離株和MDV參考毒株序列進(jìn)行序列比對(duì)分析及遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDV分離株Meq基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)過PCR擴(kuò)增，從17個(gè)MDV分離株中均擴(kuò)增出特異性PCR產(chǎn)物，其中絕大部分分離株如HNGS101、HNXZ101和HNLC107等的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與GX0101大小一致，片段長(zhǎng)度約為1 020 bp，均與預(yù)期長(zhǎng)度相符；另2個(gè)分離株HNGS201和HNLC503的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較預(yù)期稍大，而陰性對(duì)照CEF細(xì)胞中未擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物(圖1)。

圖 1 MDV Meq基因的PCR擴(kuò)增

2.2 MDV分離株Meq基因的核苷酸序列分析

序列分析結(jié)果表明，大部分毒株的Meq基因DNA序列大小均為1 020 bp，但分離株HNGS201 和HNLC503的長(zhǎng)度分別為1 200 bp和1 197 bp。對(duì)分離株與MDV參考毒株Meq基因的ORF核苷酸序列進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)這些MDV分離株之間或分離株與參考毒株之間的核苷酸同源性為99.0%～100%。

2.3 MDV分離株Meq蛋白的氨基酸序列分析

將MDV河南分離株與各參考毒株的Meq基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，分離株與參考株之間氨基酸存在一定的差異(圖2)。河南分離株與MDV參考毒株Meq基因推導(dǎo)的氨基酸在71, 77, 80,115,119,139,153,176,180和217共10個(gè)位點(diǎn)存在突變，這些位點(diǎn)分別是71(S→A),77(K→E),80(D→Y),115(V→A),119(R→C),139(T→A),153(Q→P),176(P→R),180(A→T)和217(P→A)，大部分毒株在有些位點(diǎn)存在相似的突變。分離株HNGS201、HNLC503、HNLH304與mMDV 疫苗株CVI988、814具有相似的突變位點(diǎn)。vv+MDV 648A在119,153,176,180具有獨(dú)特的突變位點(diǎn)，分別是119(C→R),153(P→Q)，176(R→A)和180(T→A)。分離株HNGS101、HNGS206、HNLC107、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNSC105 第139位的T突變成了A。除HNGS201、HNLH304和 HNLC503外，其他河南分離株176位的氨基酸突變?yōu)镽而217/277位的氨基酸突變?yōu)锳。HNGS201 和 HNLC503分別在194～253、194～252之間有60個(gè)氨基酸和59個(gè)氨基酸的插入(圖2)。

圖 2 MDV河南分離株與參考毒株Meq基因編碼的氨基酸序列的比較

2.4 MDV河南分離株Meq基因的遺傳進(jìn)化分析

用MEGA(version4.0)分析軟件構(gòu)建MDV河南分離株和參考毒株的Meq基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)這些分離株和參考株共組成了3個(gè)分支，其中國(guó)外強(qiáng)毒株GA、RB1B和648A單獨(dú)形成一個(gè)分支；絕大部分河南分離株如HNXZ101、HNGS101和HNLH302等組成一個(gè)較大的分支，而另外3個(gè)河南分離株HNGS201、HNLH304和HNLC503與mMDV 毒株CVI988和814位于同一分支上。

3 討 論

近年來，MDV毒力不斷增強(qiáng)并出現(xiàn)了vv+MDV的流行[4]，但目前仍不清楚MDV野毒株毒力增強(qiáng)的主要原因。有研究者認(rèn)為，毒力增強(qiáng)可能與免疫雞群中MDV 毒力基因復(fù)制過程發(fā)生突變有關(guān)[8]。某些MDV毒株測(cè)序結(jié)果表明，MDV的毒力可能與Meq基因顯著的多態(tài)性和點(diǎn)突變有關(guān)，破壞PRRs伸展的突變株往往有較高的毒力，且PRRs突變的次數(shù)越多毒力越強(qiáng)[9-11]。也有研究表明，Meq蛋白C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的A217和N末端亮氨酸拉鏈區(qū)的E77、Y80、A115的獨(dú)特突變與Meq蛋白的轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)有關(guān)，且115位點(diǎn)或堿性區(qū)域2(Basic region 2，BR2)的突變可能比PRRs突變的影響更大[12-13]。施維松等[14]研究發(fā)現(xiàn)，有3株中國(guó)分離毒株的Meq在139、176、217位氨基酸均發(fā)生了突變，并且有2處變化是近幾年國(guó)內(nèi)分離毒株特有的。本研究中使用的強(qiáng)毒、超強(qiáng)毒、特超強(qiáng)毒的幾個(gè)參考毒株在E77、Y80、A115、A217均有相似的突變位點(diǎn)，且具有較近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，這些氨基酸的突變可能影響Meq的轉(zhuǎn)錄激活且與毒株的毒力有一定關(guān)系。毒力最強(qiáng)的參考株648A在153和176位有2次突變破壞PRRs的伸展。而河南分離株中，HNLC202、HNLC203、HNLC401、HNGS101、HNGS206、HNLC107、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNSC105等11個(gè)分離株在176和217位均有2 處突變破壞PRRs的伸展，HNLH302、HNLH303、HNLH305僅在217位1處突變破壞PRRs的伸展，這一突變是否與其毒力有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。另外，HNGS101、HNGS206、HNLC107、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNSC105等8株河南分離株均具有一個(gè)獨(dú)特的A139替換，這個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變是否與其毒力有關(guān)，還需要開展更多的研究來證實(shí)。Meq基因系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明，河南分離株HNGS201、HNLH304和HNLC503與mMDV 弱毒疫苗株CVI988、814位于同一分支,且它們的氨基酸突變位點(diǎn)也基本一致，說明這些分離株有可能是疫苗變異株或弱毒變異株。

圖 3 MDV Meq基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Meq基因內(nèi)富含脯氨酸重復(fù)區(qū)的59個(gè)或60個(gè)氨基酸編碼基因的擴(kuò)增，主要出現(xiàn)在較低毒力的MDV毒株中，如CVI988 和CU-2[9]，但對(duì)澳大利亞和波蘭的MDV分離株的研究表明，這種插入也可能發(fā)生在強(qiáng)毒株[15-16]。也有研究表明，MDV致弱毒株Meq基因片段比致瘤毒株的片段長(zhǎng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，僅在HNGS201和HNLC503這2株可能為mMDV的毒株內(nèi)出現(xiàn)Meq基因177或180 bp堿基的插入，而強(qiáng)毒株或其他弱毒株如HNLC304與疫苗株814株并沒有插入。177或180 bp堿基的插入是否可以作為區(qū)分強(qiáng)弱毒株的參考及其在MDV致病性方面的潛在作用值得進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，在河南省的雞群中可能流行著不同毒力的MDV，一些毒株的Meq基因存在177或180 bp堿基的插入，這些毒株可能是mMDV毒株，但還需通過動(dòng)物試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為河南省MDV的流行情況提供了重要的參考信息，同時(shí)也為今后更好地防控MD奠定了基礎(chǔ)。

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