張錦興 李運(yùn)景 李卓亞

微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目。為確保微生物限度檢查方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從2005年開始至現(xiàn)行2010年版《中國藥典》規(guī)定藥品的微生物限度檢查應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[1]。熒光素鈉滴眼液是中山市人民醫(yī)院配制的供院內(nèi)使用的常用制劑，由熒光素鈉和碳酸氫鈉組成，臨床用于眼角膜損傷和角膜潰瘍的診斷，為確保檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和可靠性及保證患者用藥安全、有效，對該品種微生物限度檢查進(jìn)行了計(jì)數(shù)方法及控制菌檢查方法的驗(yàn)證[2]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CS101-1EB電熱鼓風(fēng)干燥箱(JS029)，DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱(JS031)，SHH-250L電熱恒溫培養(yǎng)箱(JS039)。

1.2培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：3101692，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，玫瑰紅納瓊脂(批號：120717，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號：3101620，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：201010153，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供)。

1.3菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕、大腸埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)〔CMCC(B) 63 501〕、白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕、黑曲霉菌(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕。以上菌種由杭州微球生物技術(shù)有限公司提供為微生物培養(yǎng)基控品。

1.4藥品 熒光素鈉滴眼液(中山市人民醫(yī)院生產(chǎn)，批號：20130520,20130721,20130922)。

2 方法與結(jié)果

根據(jù)《中國藥典》2010版二部附錄XI J 微生物限度檢查法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.1菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.1.1菌液制備 使用前注入1.1 ml稀釋液溶解，混勻使用。

2.1.2供試液制備 取供試品10 ml，加pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，作為1 ∶ 10供試液。

2.1.3驗(yàn)證方法 ①試驗(yàn)組：取1 ∶ 10供試液1 ml分別注入10個(gè)平皿中，再依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5種菌的菌懸液各1 ml(菌數(shù)為50～100cfu/ml)，每株菌平行制備2個(gè)平皿，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，分別置30～ 35℃培養(yǎng)48 h和23～28℃培養(yǎng)72 h。②菌液組：分別取上述稀釋的菌液1 ml注入平皿內(nèi)，每個(gè)菌株平行制備2個(gè)平皿，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，分別置30～35℃培養(yǎng)48 h和23～28℃培養(yǎng)72 h。測定所加的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。③供試品對照組：取1 ∶ 10供試液1 ml按試驗(yàn)組方法(不加試驗(yàn)菌)，測定供試品的本底菌數(shù)。④標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：試驗(yàn)組的回收率應(yīng)不低于70%[3]。

2.1.4結(jié)果 以上試驗(yàn)結(jié)果表明，采用平皿法檢驗(yàn)熒光素鈉滴眼液，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均大70 %。因此，熒光素鈉滴眼液的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定可采用平皿法進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2控制菌檢查方法驗(yàn)證[4]大腸埃希菌檢查，結(jié)果見表2。

2.2.1陽性對照試驗(yàn) 取1 ∶ 10供試液10 ml和10～100 cfu的大腸埃希菌，同時(shí)接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依據(jù)大腸埃希菌檢查法試驗(yàn)。

2.2.2陰性對照試驗(yàn) 取1 ∶ 10供試液10 ml和10～100 cfu的金黃色葡萄球菌，同時(shí)接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依據(jù)大腸埃希菌檢查法試驗(yàn)。

2.2.3供試品對照組 取1 ∶ 10供試液10 ml，接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中依據(jù)大腸埃希菌檢查法試驗(yàn)。

表1 熒光素鈉滴眼液細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)三次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表2 大腸埃希菌檢查驗(yàn)證結(jié)果

注：“+”： 紫外燈光下呈熒光及MUG反應(yīng)呈陽性； “-”： 紫外燈光下不呈熒光及MUG反應(yīng)呈陰性

上述方法陽性對照組檢出了大腸埃希菌，陰性對照組未檢出大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，供試品組未檢出大腸埃希菌。說明驗(yàn)證方法通過。

3 討論

3.1驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明熒光素鈉滴眼液無抑菌作用，可直接取樣按常規(guī)方法進(jìn)行微生物限度檢查。

3.2微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代次數(shù)不得超過5代，并需要定期進(jìn)行菌種鑒定，以檢查菌種有無變異或污染，保證驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3用常規(guī)法進(jìn)行計(jì)數(shù)驗(yàn)證時(shí)，在加供試品與菌液至平皿時(shí)應(yīng)將其盡可能點(diǎn)散開，即用點(diǎn)注的方法使其均勻地分布于整個(gè)平皿，傾入培養(yǎng)基后充分搖勻，這樣不容易出現(xiàn)供試品與菌液分散不均致回收率計(jì)數(shù)重現(xiàn)性不高的現(xiàn)象[5]。

3.4枯草芽孢桿菌在平皿上生長時(shí)容易粘連成片，影響計(jì)數(shù)，可將50～100 cfu菌液于平皿上充分點(diǎn)散開，倒入瓊脂后充分搖勻后，菌落呈點(diǎn)狀，易于計(jì)數(shù)[6]。

[1] 國家藥典委員會. 《中國藥典》二部. 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010, 附錄XIJ.

[2] 高捷. 復(fù)方甘草口服溶液微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn). 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,19(5) : 30-31.

[3] 國家藥典委員會.《中國藥典》. 二部. 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010，附錄XIJ: 108-109.

[4] 國家藥典委員會.《中國藥典》. 二部. 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010，附錄XIJ: 111.

[5] 張婷,鄭紹忠,劉全芳.復(fù)方呋喃西林滴鼻液微生物限度檢查的驗(yàn)證.中國藥房，2011, 22(45): 4274-4276.

[6] 張婷, 鄭紹忠, 劉全芳. 鹽酸麻黃堿滴鼻液微生物限度檢查的驗(yàn)證. 海峽藥學(xué)，2011, 23(1): 53-54.