陳芳芳

（深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

MMP-9在真菌感染合并胎膜早破胎膜組織中的表達(dá)及意義

陳芳芳

（深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

胎膜早破；真菌感染；表達(dá)

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指孕婦在臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生破裂，包括足月胎膜早破和早產(chǎn)胎膜早破。PROM是影響孕婦及胎兒健康安全的常見妊娠并發(fā)癥之一。PROM占足月妊娠的10%，占早產(chǎn)的2%～3.5%[1,2]。發(fā)生胎膜破裂后由于其屏障作用消失，胎兒和羊水暴露，使圍生期孕產(chǎn)婦及胎兒的發(fā)病率、病死率升高。胎膜早破與多種因素有關(guān)，其中包括感染、炎癥等因素引起的絨毛膜羊膜炎對(duì)胎膜結(jié)構(gòu)的直接破壞。此外，胎膜本身結(jié)構(gòu)的改變以及細(xì)胞外基質(zhì)的破壞也是胎膜早破的重要原因[3]。

基質(zhì)金屬酶是一組能降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，其中基質(zhì)金屬酶-9（MMP-9）能裂解彈性蛋白纖維、連接蛋白和膠原（維持羊膜韌性的主要物質(zhì)），使局部胎膜抵抗張力的能力下降。胎膜組織中MMP-9表達(dá)增加是胎膜早破的重要獨(dú)立因素之一。本研究通過研究真菌感染合并胎膜早破患者胎膜組織中MMP-9的表達(dá)，探討真菌感染造成胎膜早破的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 胎膜早破的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照豐有吉主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》，人民衛(wèi)生出版社出版，2005年。

1.2 病例選擇和實(shí)驗(yàn)分組：選擇2011年1月至2012年6月在本院產(chǎn)科住院的真菌性陰道炎并發(fā)胎膜早破患者32例，平均孕周為（36.4±4.1）周，平均年齡（27.3±5.2）歲。選取同期住院有剖宮產(chǎn)指征而選擇性剖宮產(chǎn)的病例（在剖宮產(chǎn)前無(wú)臨產(chǎn)癥狀，無(wú)胎膜早破）30例為對(duì)照組，平均孕周為（35.7±4.3）周，平均年齡為（25.2±4.8）歲。

1.3 標(biāo)本處理方法：胎盤娩出后，立即在距胎膜破口5 cm處取2.0 cm× 10.0 cm胎膜標(biāo)本制成胎膜卷，即刻置10%福爾馬林溶液中固定。經(jīng)脫水，石蠟包埋后切片。切片置于60 ℃烤箱過夜，常規(guī)脫蠟至水，予以高溫高壓組織抗原修復(fù)后，常規(guī)HE染色和免疫組化染色。MMP-9抗體為多克隆抗體，購(gòu)于Santa-Cruz公司。免疫組化實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為TBS緩沖液代替一抗，MMP-9陽(yáng)性片為乳腺癌腫瘤組織切片。

1.4 絨毛膜羊膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：胎膜病理切片HE鏡檢，急性絨毛膜羊膜炎分期采用2003年Redline提出新的絨毛膜羊膜炎分期方案，Ⅰ期（早期）：母體中性粒細(xì)胞位于絨毛膜板下纖維蛋白中和（或）胎膜的蛻膜層與絨毛膜交界處。Ⅱ期（中期）：中性粒細(xì)胞位于絨毛膜板的結(jié)締組織和胎膜的絨毛膜羊膜中。Ⅲ期（晚期）：壞死性絨毛膜羊膜炎。羊膜基底膜過度紅染，中性粒細(xì)胞核碎解、壞死及羊膜上皮細(xì)胞脫落。

1.5 血清MMP-9含量檢測(cè)：所有孕婦入院時(shí)抽取靜脈血5 mL，置-20 ℃冰箱內(nèi)保存供檢測(cè)使用。采用ELISA方法檢測(cè)血清MMP-9含量。

1.6 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：MMP-9定位于細(xì)胞胞質(zhì)，其免疫組化陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

具體陽(yáng)性評(píng)分方法和標(biāo)準(zhǔn)如下：觀察陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)的一個(gè)高倍鏡視野中的所有細(xì)胞，記錄胎膜細(xì)胞呈陽(yáng)性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（%）并計(jì)分。陰性：胎膜細(xì)胞顯色與背景一致，無(wú)目標(biāo)細(xì)胞染色，計(jì)0分；陽(yáng)性＋：1%～25%，1分；陽(yáng)性＋＋：26%～50%，2分；陽(yáng)性＋＋＋：51%～75%，3分；陽(yáng)性＋＋＋＋76%～100%，4分。

讀片時(shí)采用雙盲計(jì)分，為避免同一張片子不同區(qū)域染色程度不一樣，選擇10個(gè)高倍鏡視野，取結(jié)構(gòu)良好，染色均勻的中間值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理：免疫組化評(píng)分采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，選擇兩總體方差不齊的兩樣本t檢驗(yàn)對(duì)資料加以統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 真菌感染合并胎膜早破的胎膜組織表現(xiàn)嚴(yán)重的絨毛膜羊膜炎：所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)病理切片并HE染色后觀察，結(jié)果表明：真菌感染會(huì)引起胎膜組織出現(xiàn)嚴(yán)重的的絨毛膜羊膜炎（圖1），主要表現(xiàn)為：胎膜中可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胎膜組織結(jié)構(gòu)受到破壞。真菌感染組32例患者中，21例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅲ期，7例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅱ期，4例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅰ期。對(duì)照組30例患者中，3例為急性絨毛膜羊膜炎Ⅰ期，27例絨毛膜羊膜未見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（表1）。

圖1 胎膜早破組織HE染色結(jié)果，可見存在不同程度的絨毛膜羊膜炎（A為Ⅰ期；B為Ⅱ期；C為Ⅲ期）

表1 真菌感染組與對(duì)照組胎盤胎膜病理結(jié)果

2.2 胎膜早破患者血清MMP-9升高：在本研究中，血清MMP-9含量用ELISA法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明胎膜早破組血清MMP-9含量（697.5 pg/mL）明顯高于對(duì)照組（278.6 pg/mL），差異有顯著性（t=15.67，P=0.000），表明真菌感染會(huì)激活MMP-9表達(dá)，使其在體內(nèi)的含量增加。

表2 兩組血清MMP-9含量比較

2.3 MMP-9在胎膜組織中的表達(dá)：局部胎膜組織中的MMP-9表達(dá)采用免疫組化的方法進(jìn)行檢測(cè)。MMP-9主要在胎膜中的羊膜上皮、絨毛膜上皮及間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，其中陽(yáng)性信號(hào)位于胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒（圖2）。

圖2 MMP-9在胎膜組織中的表達(dá)（A為胎膜早破組；B為對(duì)照組）

免疫組化評(píng)分的結(jié)果顯示（表2），真菌感染合并胎膜早破的胎膜組織中，MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)（4.78±1.09）明顯高于對(duì)照組的胎膜組織（2.43±0.80），差異有顯著性（t=9.62，P=0.000），表明真菌感染能誘導(dǎo)MMP-9在局部胎膜組織中的高表達(dá)，這可能是真菌感染后，胎膜早破發(fā)生率增加的原因之一。

表2 MMP-9在對(duì)照組和胎膜早破組表達(dá)差異

3 討 論

在懷孕過程中，胎膜可以使羊膜腔保持相對(duì)隔離的無(wú)菌狀態(tài)，為胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。并且，隨著孕程延續(xù)，胎膜會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化以適應(yīng)逐漸增長(zhǎng)的胎兒和子宮。近年來(lái)，研究者對(duì)胎膜早破的原因進(jìn)行了多方位的探討。目前公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為PROM應(yīng)該是多因素、多途徑共同作用的結(jié)果。

其中，感染是造成胎膜早破的重要原因，包括細(xì)菌感染[4]、支原體衣原體感染[5]及真菌感染，其中上行性感染又為最常見的感染途徑。微生物局部生長(zhǎng)繁殖直接對(duì)胎膜組織的破壞及微生物刺激局部多種炎性介質(zhì)的分泌進(jìn)而出現(xiàn)絨毛膜羊膜炎是引起胎膜早破的重要原因，此外，感染還可以通過其他方式誘導(dǎo)產(chǎn)生胎膜早破，如上調(diào)MMP–9的表達(dá)。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組能降解細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶。MMPs是一個(gè)大家族，同一種MMP可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，而某一種細(xì)胞外基質(zhì)又同時(shí)是多種MMPs的作用底物。其中，研究較為透徹的是MMP-9。在分娩啟動(dòng)前，宮頸處胎膜中MMP-9的活性顯著升高，提示MMP-9參與胎膜中膠原的程序性溶解過程[3]。在分娩后，孕產(chǎn)婦羊水和胎膜中MMP-9的表達(dá)也明顯增高，且胎膜中Ⅳ型膠原含量明顯下降，提示了MMP-9可能是胎膜破裂發(fā)生的重要生理基礎(chǔ)[6]。因而，當(dāng)MMP-9異常表達(dá)過度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解加快，導(dǎo)致胎膜強(qiáng)度、韌性下降，胎膜結(jié)構(gòu)弱化，誘發(fā)出現(xiàn)胎膜早破。

本研究比較了真菌感染合并胎膜早破組與對(duì)照組（沒有發(fā)生胎膜早破病例）的血清MMP-9水平、胎膜組織MMP-9的表達(dá)及絨毛膜羊膜炎的嚴(yán)重程度。結(jié)果表明在妊娠過程中發(fā)生陰道真菌感染會(huì)導(dǎo)致胎膜出現(xiàn)嚴(yán)重的絨毛膜羊膜炎，并上調(diào)MMP-9在局部胎膜組織的表達(dá)。同時(shí)，在患者血清中也檢測(cè)到MMP-9含量增加。這些結(jié)果表明，真菌感染除了直接刺激胎膜組織出現(xiàn)炎性損傷，還可通過某種途徑增加MMP-9的表達(dá)，多種炎性介質(zhì)可能參與了之一過程。

在正常生理情況下，MMP-9在體內(nèi)的合成、分泌、降解均處于機(jī)體嚴(yán)格調(diào)控下，其在體內(nèi)的分布和含量具有組織特異性。研究表明，炎癥過程中的多種炎性因子如白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子等可誘導(dǎo)MMP-9合成[7]。而MMP-9也可以激活白細(xì)胞介素8的表達(dá)，二者呈正性反饋調(diào)節(jié)[7]。MMP-9表達(dá)增高與炎性進(jìn)展相互推動(dòng)、相互促進(jìn)，最終造成胎膜組織破壞。

胎膜早破是嚴(yán)重危害圍生期孕產(chǎn)婦及胎兒的健康安全的重要因素。目前認(rèn)為，多種因素參與到PROM的發(fā)生過程中。本研究探討了真菌感染導(dǎo)致胎膜早破的機(jī)制，我們認(rèn)為感染所致的炎性變化與MMP-9表達(dá)的上調(diào)是導(dǎo)致PROM發(fā)生的原因。此外，MMP-9表達(dá)增加，降解胎膜細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而破壞胎膜的完整性、韌性和強(qiáng)度。我們認(rèn)為，上述過程可能是多種因素造成胎膜早破發(fā)生的最終通路和直接原因。

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R714.4

：B

：1671-8194（2014）31-0075-02

深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃社會(huì)公益項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：外陰陰道念珠菌病與胎膜早破的關(guān)系及預(yù)防應(yīng)用抗生素對(duì)妊娠結(jié)局的影響，編號(hào)為2010542）