管淑紅 周 軍 徐乾乾*

（蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院，江蘇 常州 213000）

白細胞介素-33在慢性阻塞性肺疾病患者體內(nèi)的表達及變化規(guī)律的研究

管淑紅 周 軍 徐乾乾*

（蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院，江蘇 常州 213000）

目的 研究白細胞介素-33（IL-33）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者體內(nèi)的表達及其因病情不同轉(zhuǎn)歸而動態(tài)改變的規(guī)律。方法 31例COPD急性加重期（AECOPD）患者依據(jù)GOLD診斷分級標(biāo)準(zhǔn)分三組：輕度組，中度組和重-極重度組，實時熒光定量RT-PCR檢測患者治療前后外周血單個核細胞IL-33的基因表達。結(jié)果 健康人及輕度COPD患者IL-33基因表達維持在低水平，中度和重-極重度患者其表達明顯增加，急性加重時升高尤為明顯，治療后病情緩解IL-33表達水平也隨之下調(diào)。結(jié)論 COPD患者體內(nèi)表達IL-33水平隨病情嚴(yán)重程度而升高，病情惡化或好轉(zhuǎn)時，IL-33表達水平都隨之同步改變。

白細胞介素-33；慢性阻塞性肺??；實時熒光定量RT-PCR

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以氣流受限不完全可逆為特征的疾病。氣道炎癥尤其是小氣道炎癥是COPD的主要病變及發(fā)病的主要原因。COPD在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率不斷上升，至2007年，在我國農(nóng)村COPD已成為第一位的死亡殺手[1]，目前是全球第四大死亡原因[2]。COPD越來越受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家的廣泛關(guān)注和重視，目前普遍認為COPD是一種復(fù)雜的慢性氣道炎癥，眾多細胞因子構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，Th2型細胞因子優(yōu)勢是COPD發(fā)病機制之一[3]。白細胞介素-33（IL-33）是新近發(fā)現(xiàn)的Th2型細胞因子，已有研究證實IL-33與氣道高反應(yīng)密切相關(guān)[4]，本課題旨在研究IL-33在COPD患者體內(nèi)的表達及其動態(tài)改變的規(guī)律。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象：參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會COPD學(xué)組的診斷標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇2011年9月至2012年12月蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科AECOPD患者31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①咳嗽、咳痰病史連續(xù)2年以上；②肺功能檢查，吸入支氣管舒張劑后，F(xiàn)EV1/FVC＜70%；③符合文獻[5]COPD急性加重（AECOPD）的1型和2型標(biāo)準(zhǔn)，即氣促加重、痰量增加和痰轉(zhuǎn)膿性3項癥狀至少存在2項。排除合并有左心功能不全、心肌梗死、冠心病、房顫、慢性肝腎功能不全、腫瘤、急性肺栓塞、彌漫性間質(zhì)性肺病、氣胸或縱隔氣腫、血管炎性疾病、結(jié)締組織疾病等疾病的患者；按照GOLD診斷分級標(biāo)準(zhǔn)[6]，輕度13例，中度11例，重-極重度7例。其中男18例，女13例，年齡55～85歲，平均年齡（69±6）歲。對照組為同期健康體檢者9例。各組患者性別年齡構(gòu)成比均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬三院倫理委員會審查批準(zhǔn)。凡符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者均告知本研究的目的及試驗方法，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：AECOPD患者入院后24 h內(nèi)抽空腹靜脈肝素抗凝血5 mL，后給予抗生素為主的綜合治療，如患者咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困難、發(fā)熱等癥狀明顯好轉(zhuǎn)（呼吸困難、咳嗽、咯痰和喘息等癥狀穩(wěn)定或癥狀輕微，有發(fā)熱者體溫已降至正常3 d），并結(jié)合血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白、血沉、痰培養(yǎng)、胸部影像學(xué)等檢查結(jié)果抽空腹靜脈肝素抗凝血5 mL。對照組抽空腹靜脈肝素抗凝血5 mL。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR法檢測IL-33的表達：提取每個外周血標(biāo)本分離的單個核細胞，采用Trizol法提取總RNA，按照操作說明書進行，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃中備用。IL-33引物：上游5′-AAATGAATCAGGTGACGGTGTT-3′，下游5′-CC ACAGAGTGTTCCTTGTTGTTG-3′；內(nèi)參β-actin引物：上游5′-AAGGTGACAGCAGTCGTT-3′，下游5′-TGTGTGGACTTGG GAGAGG-3′。總體系為20 μl，主要反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，之后94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，共進行40個循環(huán)后進行溶解曲線的檢測。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)定義為Ct值；每對引物在每個模板中做2個重復(fù)管，得到的Ct值取平均值；IL-33基因的Ct平均值減去β-actin的Ct平均值，得到△Ct。IL-33基因的表達量用2-△Ct表示。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0軟件，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ ±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，多個樣本之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，同組患者治療前后比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

31例AECOPD患者歷經(jīng)綜合治療后，除2例重-極重度患者未能達到COPD穩(wěn)定期，余29例患者病情均得到明顯好轉(zhuǎn)，處COPD穩(wěn)定期。

實時熒光定量RT-PCR法檢測40例入院對象外周血單核細胞中均有IL-33基因表達，對照組及輕度COPD患者其基因表達維持在低水平，中度和重-極重度患者IL-33mRNA表達明顯增加，反映IL-33水平與病情嚴(yán)重程度成正相關(guān)。COPD患者病情變化、急性加重時，IL-33基因表達水平呈顯著升高，積極治療后如病情能得到有效緩解，IL-33mRNA表達也能隨之同步下調(diào)，反之則維持在較高水平。

表1 各組患者外周血中單個核細胞IL-33基因表達的動態(tài)變化（）

表1 各組患者外周血中單個核細胞IL-33基因表達的動態(tài)變化（）

組別 例數(shù) IL-33急性加重期 緩解期對照組 9 6.434E-06±2.000E-06輕度COPD組 13 3.842E-04±2.185E-043.216E-05±2.491E-05中度COPD組 11 1.817E-02±0.304E-029.335E-03±2.692E-03重-極重度COPD組 5 6.329E-02±2.335E-022.693E-02±0.339E-02

注：無論是COPD急性加重期還是緩解期，各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異，每組治療前后、即急性加重期與緩解期之間也均有統(tǒng)計學(xué)意義

表2 兩例重-極重度COPD未緩解患者治療前后外周血中單個核細胞IL-33基因表達的動態(tài)變化

圖1 實時熒光定量RT-PCR擴增曲線

圖2 實時熒光定量RT-PCR溶解曲線

3 討 論

COPD氣道炎癥的本質(zhì)、特點及其炎癥機制認識尚不十分明確，但目前普遍認為COPD是一種復(fù)雜的慢性氣道炎癥，涉及多個方面的病理生理過程，包括激活的炎性細胞釋放的多種遞質(zhì)。細胞因子是機體許多細胞特別是免疫細胞合成和分泌許多種微量的多肽類因子，它們在細胞間傳遞信息、是具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。細胞因子依據(jù)其分泌來源不同，分為Th1型細胞因子（如IL-2、IL-12、IL-18等）和Th2型細胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13等），近年來有關(guān)Th1型/Th2型細胞因子平衡的變化與COPD關(guān)系的研究進展非常迅速，這些研究初步闡明了人類Th1型/Th2型細胞因子參與CPOD的病理和生理作用，并為Th1型/Th2型細胞因子介導(dǎo)的COPD的臨床治療提供了理論依據(jù)[3]。Th2型細胞因子優(yōu)勢是COPD發(fā)病機制之一，Th2型細胞因子可削弱機體對感染因子的保護性防御機制，并?？赡茉谶z傳易感的宿主引發(fā)過敏性特應(yīng)征[7]。矯正Th1型/Th2型細胞因子二者之間的失衡，促使它們保持動態(tài)平衡，將十分有利于COPD轉(zhuǎn)歸。

IL-33是新近發(fā)現(xiàn)的Th2型細胞因子。IL-33信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Th2型細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等的產(chǎn)生和隨后的生物學(xué)功能發(fā)揮[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33通過其受體激活信號傳導(dǎo)通路后可以加重黏膜組織的病理性損傷[9]。Komai-Koma等[10]發(fā)現(xiàn)IL-33是一種體內(nèi)外Th2細胞的有力的趨化劑，在體外，重組IL-33能增加Th2細胞的比例、以IL-33濃度依賴的方式誘導(dǎo)Th2細胞形態(tài)學(xué)上的改變并使其遷移進入膠原基質(zhì)；在體內(nèi)則吸引過繼轉(zhuǎn)移的Th2細胞到IL-33注射的部位。因此，IL-33通過主動募集Th2細胞到炎癥位點，而使IL-33在維持炎癥中起關(guān)鍵的作用。在體外實驗中[9]，重組人IL-33（rhIL-33）與Th2細胞孵育能增加Th2細胞產(chǎn)生IL-5和IL-13，而rhIL-33與Th1細胞孵育能降低Th1細胞產(chǎn)生干擾素的水平。用rhIL-33進行體內(nèi)研究[9]發(fā)現(xiàn)，將rhIL-33腹膜內(nèi)注射到小鼠后導(dǎo)致小鼠的胸腺、脾、肝和肺中IL-4和IL-5 mRNA水平增高，血清中IL-5和IL-13水平增高。同時，rhIL-33處理小鼠引起嚴(yán)重的肺和消化道的病理改變，包括免疫細胞浸潤、黏液產(chǎn)生增加和上皮增生與肥大[9]。

因此，IL-33不僅是Th2型細胞因子的代表，它更可以生成其他Th2型細胞因子如下游的細胞因子IL-4、IL-5、IL-13等加重Th2型細胞因子優(yōu)勢作用，通過削弱機體會感染的防御能力、增加宿主氣道高反應(yīng)等機制促進COPD病情進展惡化，是反映病情的可靠指標(biāo)之一。

本研究中納入40例研究對象，分成四組，從健康者、輕度COPD患者、中度COPD患者至中-重度COPD患者，構(gòu)成完整的病情梯隊，代表了COPD病情各個階段的嚴(yán)重程度，分別檢測40例患者外周血單個核細胞中IL-33基因表達情況，結(jié)果提示其表達水平與病情嚴(yán)重程度同步上調(diào)，感染誘發(fā)COPD急性加重時升高尤為明顯，且治療后病情獲得緩解時IL-33基因表達也隨之下降，提示IL-33可能參與COPD發(fā)生、發(fā)展及惡化過程，是COPD病情變化及轉(zhuǎn)歸的預(yù)警信號之一，阻斷IL-33靶點或許是未來治療COPD的有效手段。但本課題樣本量偏小，尤其是治療后無明顯緩解的AECOPD患者僅為兩例，尚不能構(gòu)成統(tǒng)計學(xué)意義，課題組將后續(xù)擴大樣本量進一步深入研究。

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The Study of the Expression of IL-33 in Patients with COPD and it's Dynamic Changes with Different Respond to Treatment

GUAN Shu-hong, ZHOU Jun, XU Qian-qian*
(Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou 213000, China)

Objective To study the expression of Interleukin-33(IL-33) in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and its dynamic changes with different respond to treatment. Methods 31 patients with acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease (AECOPD) were grouped according to the GOLD COPD classifications: mild group, moderate group and severe-very severe group. The expression of IL-33 mRNA in peripheral blood mononuclear cells was determined by Real-time fluorescent quantitative RT-PCR before and after treatment. Results The expression of IL-33 mRNA was maintained at a low level in control group and mild group, but significantly increased in moderate group and severe-very severe group. The upward trend was especially apparent in COPD patients at acute exacerbation phase. When condition improved, the level was downwad. Conclusion The expression of IL-33 in patients with COPD is increased with the severity of the disease and changed simultaneously when condition deteriorated or improved.

Interleukin-33; Chronic obstructive pulmonary disease; Real-time fluorescent quantitative RT-PCR

R563.9

：B

：1671-8194（2014）31-0003-02

江蘇省2013年省級前瞻性研究專項資金（BE2013629）

*通訊作者:E-mail: 48257304@qq.com