任 亮， 張洪斌， 胡雪芹， 牛博藝

(合肥工業(yè)大學 制藥工程系， 合肥 230009)

右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，EC2.4.5.1)是一種由腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)和口腔鏈球菌(oralstrepotococcus)產(chǎn)生的葡萄糖基轉移酶(glucosyltransferases)[1]。該酶屬于糖苷水解酶第70家族(Family 70)，是葡聚糖蔗糖酶領域中研究較早較熱門的一類酶[2]。右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖為底物[3]，將蔗糖分子中D-葡萄糖基催化轉移到受體分子。右旋糖酐蔗糖酶可以催化2種反應，一種是形成右旋糖酐，另一種是受體的糖基化反應[4]。

利用右旋糖酐蔗糖酶的轉糖基作用，以碳水化合物作為受體，可以合成多種低聚糖[5]，例如，Rodrigues等利用右旋糖酐蔗糖酶，以蔗糖為糖基供體，麥芽糖為糖基受體，生成新的寡糖6-a-葡萄糖基麥芽糖[6]。Díez-Municio等利用右旋糖酐蔗糖酶，以蔗糖為糖基供體，乳果糖為糖基受體，合成了一種新的三糖，乳果糖蔗糖[7]。右旋糖酐蔗糖酶還可以以天然產(chǎn)物作為糖基受體，合成新的糖苷類化合物[8]，并在一定程度上提高它們的生理活性，例如水溶性，抗氧化性，酶抑制性等。例如，Kim等利用右旋糖酐蔗糖酶，以蔗糖為糖基供體，紫云英甙為糖基受體，得到多種紫云英甙的糖苷，相比紫云英甙，它們對基質金屬蛋白酶的表達抑制作用提高了8.3%～60.6%, 抗氧化性提高18.8%～20.3%，黑色素合成抑制率提高了3.8%～18.8%[9]。Moon等利用右旋糖酐蔗糖酶，以蔗糖為糖基供體，表沒食子兒茶素沒食子酸為糖基受體，合成了多種表沒食子兒茶素沒食子酸的糖苷，合成的幾種新的糖苷類化合物的水溶性分別提高了69、126和122倍[10]。Woo等利用右旋糖酐蔗糖酶合成了蛇葡萄素的糖苷，合成的新的糖苷類化合物水溶解性、抗褐變、抗氧化性及酪氨酸酶抑制性的能力相比較蛇葡萄素都有一定程度的提高[11]。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射和免疫調(diào)節(jié)等諸多活性。由于大多數(shù)黃酮類化合物在水相中溶解度低， 限制了其制劑的開發(fā)。目前國內(nèi)外對黃酮類化合物進行分子修飾主要是以提高其在水相中的溶解性為目的，而對其水溶性改性所涉及的化學反應主要是糖基化。利用化學合成來進行結構修飾存在著得率低、反應專一性差、副產(chǎn)物多等缺點, 而生物轉化技術卻可彌補化學合成的不足[12]。本研究主要利用右旋糖酐蔗糖酶的轉糖基作用，在有機-水兩相中合成一種槲皮素糖苷[13]，同時研究了槲皮素糖苷的分離純化的方法和酶催化反應條件對槲皮素糖苷轉化率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源基因工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)/pET28-dexYG由本實驗室構建、保存。

1.1.2 試劑與儀器槲皮素；蔗糖；大孔樹脂(AB-8)購于天津波鴻樹脂科技有限公司；右旋糖酐蔗糖酶實驗室自制；其他試劑均為分析純，水為去離子水。GL-20G-II高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；KS-150超聲波細胞粉碎機(寧波科生儀器廠)；VIS-723紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；低溫旋蒸儀(東京理化)；Model 201高效液相色譜儀(天津埃文森科技有限公司)；Quiksep-100高壓層析系統(tǒng)(北京慧得易公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 右旋糖酐蔗糖酶的制備與酶活力的測定

右旋糖酐蔗糖酶的制備方法參照文獻[14]。

右旋糖酐蔗糖酶酶活力的測定采用DNS法，以果糖的生成速度測定酶活性大小。在 25℃下, 1 mL 底物反應液中每小時催化底物蔗糖產(chǎn)生 0.1 mg 果糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

具體步驟 : 在乙酸-乙酸鈉(0.02 mol/L、pH值5.4)緩沖液中配制蔗糖濃度為10%反應液，加入酶液在25℃反應1 h。終止反應后取樣加入DNS試劑，在沸水浴中準確加熱5 min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水定容。以未反應的對照液調(diào)零點，在波長520 nm處測量光密度值，然后計算酶活。

1.2.2 酶催化反應

配置50 mL 30%的DMSO-乙酸-乙酸鈣緩沖液(pH值5.4)于250 mL錐形瓶中，加入0.02 g槲皮素和5 g蔗糖，超聲2 min助溶，過濾后，加入1.0 mL酶液，25°C下?lián)u床中反應，不同反應時間取樣進行分析。

1.2.3 槲皮素糖苷的分離純化

1)醇沉除去右旋糖酐酶催化反應24 h后，加熱使酶失活，終止反應，再向反應液中緩慢加入無水乙醇，并不停用玻璃棒攪拌，瞬間沒有白色糖酐析出即可。

2)AB-8大孔樹脂分離純化AB-8大孔樹脂的預處理[15]：先用95%乙醇浸泡10～24 h，再用95%乙醇洗至洗脫液加入水中不顯渾濁即可，然后用水洗至無醇味，即可上樣。

將預處理過后的AB-8大孔樹脂裝柱，并將醇沉，濃縮后的反應液上柱，將樣品在大孔樹脂中吸附0.5 h，再用大量水洗脫雜質，最后用高濃度的乙醇洗脫樣品。

3)SephadexLH-20柱分離純化[16]將上述的乙醇洗脫液濃縮后上樣，先用低濃度的乙醇洗脫目標產(chǎn)物，再用高濃度的乙醇洗脫底物槲皮素。

1.3 酶催化反應條件的研究

酶催化反應以蔗糖濃度為10%，酶活力為30 U/mL，于25°C，150 r/min的恒溫搖床中反應，在第10小時、第20小時和第44小時分別取樣，測定糖基化產(chǎn)物的轉化率。

確定最佳反應時間后，酶催化反應以蔗糖濃度為10%，于25°C，酶活力分別為20、30、40、60和120 U/mL，于150 r/min的恒溫搖床中反應24 h后，取樣測定糖基化產(chǎn)物的轉化率。

確定最佳反應時間和最適酶活力后，酶催化反應的蔗糖濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、14%、18%和30%，酶活力分別為20、30和40 U/mL，于25°C, 150 r/min的恒溫搖床中反應24 h后，取樣測定糖基化產(chǎn)物的轉化率。

1.4 檢測方法

1.4.1 薄層色譜法(TLC)分析取 1 mL酶催化反應液，加入2 mL無水乙醇，醇沉除去糖酐，9000 r/min離心10 min。取上清液，用毛細管取樣，點于高效G硅膠板。槲皮素及槲皮素糖苷的展開劑為正丁醇∶乙酸∶水=5∶3∶1(v/v/v)，糖類雜質薄層條件：展開劑為正丁醇∶異丙醇∶乙酸∶水=7∶5∶4∶2(v/v/v/v)。顯色劑為苯胺，二苯胺，磷酸溶液。

圖1 槲皮素糖苷和低聚糖的薄層色譜分析

1—槲皮素標品；2—反應后，槲皮素糖苷；3—大孔樹脂水洗脫液；4—果糖標品；5—蔗糖標品；6—大孔樹脂水洗脫液中的糖類雜質；7—醇洗脫樣品前，水洗脫液中的糖類雜質。

1.4.2 槲皮素和槲皮素糖苷的HPLC檢測 Model 201高效液相色譜儀：色譜柱為C18柱(4.6 mm×150 mm)檢測器：紫外檢測器，檢測波長：373 nm，上樣量：20 μL，流速1 mL/min，洗脫液：A液，23%乙腈；B液，77%水，等梯度洗脫。

1.4.3 槲皮素糖苷的質譜(MS)分析 Thermo TSQ Quantum Quantum Ultra AM 三重四級桿質譜: 負離子模式、全掃描模式，毛細管加熱溫度：270℃，電噴霧電壓：4500V。

2 結果與分析

2.1 酶催化反應體系的研究

2.1.1 槲皮素在不同比例的有機溶劑-乙酸-乙酸鈣緩沖液(0.02 mol/L，pH=5.4)中的溶解性

槲皮素在水中的溶解度極低，需要選擇有機溶劑-緩沖液的反應體系來增加底物槲皮素的溶解性。

槲皮素在反應體系中的溶劑度的大小與其測得的OD值成正比，隨著有機試劑比例的不斷增大，槲皮素在溶劑中OD值不斷增加，說明槲皮素的溶解性也不斷增加。實驗結果表明，當采用20%以及更高有機溶劑比例的混合溶劑，槲皮素的溶解度大大提高。

表1 槲皮素在不同比例的有機溶劑-乙酸-乙酸鈣緩沖液中的OD值

2.1.2 右旋糖酐蔗糖酶在不同比例的有機溶劑-緩沖液中的酶活高低

考慮到酶在100%的有機溶劑中失活，因此實驗設計用有機溶劑和水的混合物作為反應體系，配制20%和40%乙醇、甲醇、異丙醇、DMF、DMSO的水溶液，蔗糖濃度為10%，加入酶液在25℃反應1 h。終止反應后取樣加入DNS試劑，在沸水浴中準確加熱5 min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水定容。以未反應的對照液調(diào)零點，在波長520 nm處測量光密度值，考察右旋糖酐蔗糖酶在上述體系中的酶活情況。

表2 右旋糖酐蔗糖酶在不同比例有機溶劑-緩沖液中的OD值

由1.2.1酶活公式可知，右旋糖酐蔗糖酶在反應體系中的酶活力大小與其測得的OD值成正比。由表2可知，在20%的有機溶劑-緩沖液體系中，除異丙醇-緩沖液反應體系外，右旋糖酐蔗糖酶都能維持一定的酶活，在40%的有機溶劑-緩沖液體系中，只有DMSO-緩沖液 和DMF-緩沖液還能維持一定的活力，但在20%DMSO-緩沖液反應體系中，右旋糖酐蔗糖酶的酶活最高。

2.1.3 右旋糖酐蔗糖酶在不同比例DMSO-乙酸-乙酸鈣緩沖液(0.02 mol/L，pH值5.4)中的相對活力

由圖2可知，當DMSO的比例不超過30%的情況下，酶活可以維持原來的50%，這與Emmanuelle Girard, Marie-Dominique Legoy的實驗結果相吻合。綜合考慮3個圖的實驗結果，在既能維持一定酶活，又能溶解一定量槲皮素的件下，選擇30%DMSO-乙酸-乙酸鈣緩沖液(0.02 mol/L，pH值5.4)作為酶催化的反應體系。100%的相對活力是指右旋糖酐蔗糖酶在100%乙酸-乙酸鈣緩沖液(DMSO為0%)中的酶活力，此時酶活力最高。

圖2 右旋糖酐蔗糖酶在不同比例DMSO%(v/v)中的相對活力

圖3 酶催化產(chǎn)物的HPLC檢測結果

Fig 3 The HPLC detection results of enzyme catalyzed product

a—酶催化反應前的HPLC圖譜；b—酶催化反應24 h后的HPLC圖譜；c—大孔樹脂分離純化后的HPLC圖譜；d—SephadexLH-20分離純化后，目標產(chǎn)物峰的HPLC圖譜。

2.2槲皮素及其糖基化產(chǎn)物的分離純化

通過醇沉除去大分子右旋糖酐，旋蒸除去乙醇，大孔樹脂柱除去低聚糖類雜質，Sephadex LH-20除去底物槲皮素，并收集目標產(chǎn)物槲皮素糖苷。對槲皮素及槲皮素糖苷的分離純化結果通過高效液相色譜進行檢測，每一步分離純化后的檢測結果如下圖3 a、b、c、d所示。

由酶催化產(chǎn)物分離純化后的HPLC檢測結果可知，通過分離純化，可以得到純度較高的槲皮素糖苷。

2.3 酶催化反應條件的研究

2.3.1 反應時間槲皮素糖苷轉化率的影響

在右旋糖酐蔗糖酶酶催化的反應過程中，反應時間越長，反應體系粘度越大，而較大的粘度對糖基受體，供體，酶之間的結合會有較大的影響。分別在0 h、10 h、20 h和44 h取樣檢測，考察反應時間對槲皮素糖苷轉化率的影響。實驗結果如圖4。從圖中可知，反應時間對槲皮素糖苷轉化率就有較大影響，最后選擇選擇反應20～24 h作為酶催化反應的終點。

圖4 反應時間對槲皮素糖苷轉化率的影響

圖5 酶活力對槲皮素糖苷轉化率的影響

2.3.2 酶活力對槲皮素糖苷轉化率的影響

在右旋糖酐蔗糖酶酶催化的反應過程中，酶活力越高，反應體系達到一定粘度的時間就越短，而反應體系的粘度會影響糖基受體，供體，酶之間的結合。分別考察酶活分別是20、30、40、60和120 U/mL時對酶催化產(chǎn)物槲皮素糖苷轉化率的影響，實驗結果見圖5。從圖中可知，酶活力在40 U/mL時，槲皮素糖苷轉化率最高。當酶活力大于60 U/mL，反應24 h后，反應液變像果凍一樣粘，推測可能是因為大量糖酐的生成阻礙了糖基與槲皮素之間相結合，而在較低的酶活下，反應一段時間后，反應液仍然保持一定程度的流動性，目標產(chǎn)物的轉化率也就較高。

2.3.3 蔗糖濃度和酶活力對槲皮素糖苷轉化率的影響

蔗糖作為酶催化反應的糖基供體，在反應體系溶解較多槲皮素，酶活力適宜的條件下，充足的糖基供體對糖基化產(chǎn)物的最終轉化率是有影響的。分別考察蔗糖濃度(w/v)為2%、4%、6%、8%、10%、14%、18%和30%，酶活力為20、30和40 U/mL時，對槲皮素糖基化產(chǎn)物轉化率的影響，實驗結果如圖6。從圖6中可知，當蔗糖濃度為10%，在酶活是20、30和40 U/mL時槲皮素糖苷的轉化率都比較高。當蔗糖濃度大于10%時，隨著濃度的增加，酶活的增加并沒有顯著提高槲皮素糖苷的轉化率，這說明當酶活較大時，隨著反應時間的增加，反應體系粘度變大，不利于受體與供體結合生成產(chǎn)物。而當蔗糖濃度小于5%時，可能是因為蔗糖濃度較低，反應24 h后，蔗糖被耗盡，雖然酶仍然可以參加轉糖基反應，但是沒有足夠的糖基供體，而糖基化產(chǎn)物槲皮素糖苷作為糖基供體，果糖作為糖基受體，使槲皮素糖苷的轉化率降低，當糖基供體蔗糖濃度大于8%后，又開始恢復正常，在蔗糖濃度相同，酶活較高的條件下，槲皮素糖苷的轉化率也較高。當蔗糖濃度為10%，酶活40 U/mL時，槲皮素糖苷的轉化率最高，為39.5%。

圖6 不同蔗糖濃度和酶活力對槲皮素糖苷轉化率的影響

2.4 槲皮素葡萄糖苷的質譜分析

槲皮素的分子量是302.23，每連接一個葡萄糖，分子量增加162，所以槲皮素單糖苷的分子量是464.23，由圖7 可見，質譜圖中出現(xiàn)的463.3峰為[M-H]質譜信號。由此可以斷定，TLC圖譜和HPLC圖譜中出現(xiàn)的新物質是槲皮素的單糖苷。

圖7 槲皮素糖基化產(chǎn)物的質譜圖

2.5 槲皮素葡萄糖苷結構的推測

由產(chǎn)物的分子量以及底物槲皮素的結構式可以推測產(chǎn)物可能的結構式，由圖8可知槲皮素上有5個羥基可能被糖基化。據(jù)文獻報道，來自蠟狀芽孢桿菌的葡萄糖基轉移酶可以得到多種槲皮素的糖基化產(chǎn)物，糖基化位置分別是槲皮素的5，7, 3′, 4′位羥基, 而來自腸膜狀明串珠菌的葡萄糖基轉移酶，糖基化位置主要是在槲皮素的B環(huán)上3′, 4′位羥基，文獻中還提出，槲皮素B環(huán)上兩個鄰位羥基(3′, 4′)對槲皮素是否可以被糖基化是極其重要的。所以推斷葡萄糖基可能連接到槲皮素B環(huán)上的3′, 4′位羥基上。

對槲皮素葡萄糖苷結構的準確判斷，還需要通過核磁共振氫譜來進行分析，如果葡萄糖分子連接到了4′為羥基上，由于糖分子基團的存在，會對槲皮素B環(huán)上5′位上氫原子的化學位移產(chǎn)生較大的影響，使其化學位移變大，而對槲皮素B環(huán)上2′, 6′位上氫原子的化學位移影響較小。同理，如果葡萄糖分子連接到了3′為羥基上，會對槲皮素B環(huán)上2′位上氫原子的化學位移產(chǎn)生較大的影響，使其化學位移變大。通過槲皮素葡萄糖苷1H NMR的數(shù)據(jù)與文獻中數(shù)據(jù)相比較，來進一步確定其結構。

圖8 槲皮素的結構式

3 結論

利用右旋糖酐蔗糖酶，通過轉糖基作用，在DMS0-乙酸乙酸鈣緩沖液中合成槲皮素糖苷是可行的，利用大孔樹脂(AB-8)和Sephadex LH-20分離純化后可以得到較為純凈的槲皮素單糖苷，通過薄層色譜，高效液相色譜和質譜基本可以確定酶催化產(chǎn)物就是槲皮素的單糖苷。

利用高效液相色譜測定了右旋糖酐蔗糖酶催化合成槲皮素單糖苷的轉化率，確定了得到較高轉化率槲皮素單糖苷的工藝條件，在25°C下，30%的DMSO-乙酸乙酸鈣(0.02 mol/L，pH值5.4)反應體系中，以10%的蔗糖作為糖基供體，酶活力為40 U/mL，轉速為150 r/min，反應24 h，糖基化產(chǎn)物的轉化率最高可達39.5%。

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