沈君逸， 賈玉芳， 趙 文

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023)

隨著原油工業(yè)的發(fā)展，原油污染所造成的海洋環(huán)境污染問題日漸凸顯。大規(guī)模的溢油事故對海洋的生態(tài)環(huán)境和海洋產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了災(zāi)難性的影響。全世界因油輪事故溢入海洋的石油每年約39萬t，中國沿海地區(qū)平均每4 d發(fā)生一起溢油事故。1973年至2006年，中國沿海大小船舶事故溢油量達到37077 t，近海水體系統(tǒng)長期處于不健康或亞健康狀態(tài)[1]。

原油烴化合物進入水域之后，除了揮發(fā)性和易溶性的部分迅速分散，其他大量不溶組分會被乳化分散成小顆粒，或形成固體漂浮物；原油中的沉積物會黏附于礁石或灘涂，要完全消除需要經(jīng)過數(shù)年時間。原油對水環(huán)境的危害具體表現(xiàn)為如下4個方面：1)阻礙水氣交換，破壞了初級生產(chǎn)力；2)油膜對生物造成物理損傷；3)原油中的毒性成分能使水生生物致畸或致死；4)水產(chǎn)生物或產(chǎn)品經(jīng)原油污染，肉質(zhì)變質(zhì)發(fā)臭，失去經(jīng)濟價值。

消油劑作為控制和減輕原油污染的常用手段，1967年以來大量被應(yīng)用于原油污染處理。消油劑在國標(biāo)中的定義是“可將水面浮油乳化分散或溶解于水體中的化學(xué)制劑”，其活性劑分子中有親油和親水兩種基團，從而削弱了油-水界面的張力，將油污乳化分散，易于被水中的微生物等降解，最終成為二氧化碳等產(chǎn)物，促進水體的凈化過程。但消油劑的使用也造成了新的二次污染。污染來自兩方面：消油劑自身的毒性和其乳化分散的原油毒性。早期的消油劑芳烴含量高，10 mg/L就可使大部分海洋生物致死，對海洋生態(tài)造成了嚴(yán)重破壞。目前，多采用低毒且乳化率高的酯型主劑產(chǎn)品，并在產(chǎn)品投放前進行嚴(yán)格的有效性和毒性實驗，但人們對其污染性仍然看法不一[2-3]。

針對原油和消油劑對海洋生態(tài)環(huán)境的影響，多年來，國內(nèi)外學(xué)者積累了大量的試驗結(jié)果和研究資料。在眾多的試驗方法中，魚類毒性實驗作為最基礎(chǔ)和運用最廣泛的方式，對人們了解這兩種物質(zhì)的毒性起到了重要的作用，本文對原油和消油劑對魚類毒性試驗的相關(guān)研究領(lǐng)域做了總結(jié)和展望，旨在為推進原油和消油劑的毒性生物監(jiān)測和污染防治提供參考。

1原油對魚類毒性的相關(guān)研究

1.1 原油在水環(huán)境中的毒性

原油是一種有機混合物，其主要成分是鏈烷烴以及多種環(huán)烷烴和芳香烴。在原油成分中，主要是溶解于水的組分引起了水體污染。其中易溶的芳香烴構(gòu)成了對水生生物的主要危害，而不溶成分的毒性滯留時間較長，因此，原油對水生生物既有急性毒性，也有慢性毒性。濃度較高的原油污染可引起生物的麻醉、致癌甚至致死；原油中的一些化合物成分可在生物體內(nèi)蓄積，并通過食物鏈而逐級放大，造成生態(tài)系統(tǒng)的受損。

1.2 魚類試驗在水環(huán)境毒理學(xué)中被廣泛應(yīng)用

在水環(huán)境污染的監(jiān)測和防治中，生物測試可以彌補傳統(tǒng)的理化檢測試驗無法直接獲得污染所引起生物學(xué)效應(yīng)的不足，能直觀地獲得環(huán)境污染物對生物的長期和短期影響，在其對人類健康造成的可能影響上具有較大的參考價值[4]。

魚類在生物試驗中表現(xiàn)出很多優(yōu)點，成為運用最廣泛的受試動物。魚類的品種繁多、繁殖力強、世代周期較短、培育設(shè)施簡單，適合進行遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)、毒理學(xué)、行為科學(xué)等研究，尤其適用環(huán)境重金屬污染和農(nóng)藥殺蟲劑污染檢測[5]。魚類對水質(zhì)變化非常敏感，用魚類進行監(jiān)測，除死亡外，還有多種非致死效應(yīng)引起的行為表現(xiàn)和生理指標(biāo)可用于監(jiān)測結(jié)果的判斷[6]。

魚類早期生命發(fā)育階段的胚胎和仔魚，是整個生命周期中對各種污染物最為敏感的階段。利用魚類胚胎及仔魚進行毒性實驗(EL test)，不但是一種急性實驗，也可以做為一種縮短的慢性實驗，利用全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(WEC)可以用少量動物提供足量胚胎，既節(jié)約了動物又克服了體內(nèi)試驗生殖周期長和用藥量大的缺點[7]，這也是未來的魚類毒性試驗的發(fā)展方向。2002年，德國官方批準(zhǔn)斑馬魚胚胎實驗(DarT)替代魚急性毒性試驗用于污水檢測；ECETOC推薦以魚胚胎試驗替代魚試驗檢測污水[8]。

1.3 原油對魚類的毒性

原油對污染水域中魚類的影響是多方面的。水體中散布的油顆粒會黏附在魚體、尤其是魚鰓上，造成鰓絲黏連等物理性損傷；原油對魚類的生殖發(fā)育影響很大，有時可導(dǎo)致魚類的雌性化，從而使種群的雌雄比例失調(diào)；會造成魚卵受精率低、孵化率低，引起幼魚的死亡或發(fā)育畸形。這類畸形多為脊椎扭曲和V狀彎尾，并可見少量仔魚出現(xiàn)卵黃囊腫大。通常，原油烴濃度達到0.01～0.1 mg/L時即可引起魚類的慢性中毒，其長期毒性會影響魚類的神經(jīng)系統(tǒng)，對生命活動造成影響[9]。

原油的組分差異影響其毒性大小，其中芳香烴和小烷烴越多，水溶性越大，毒性也越大。魚胚胎的毒性試驗通常要求染毒在囊胚期之前開始，并對每一發(fā)育時期作鏡檢分析，和正常健康胚胎作對比。通常，能觀察到的魚類重要致毒效應(yīng)指標(biāo)包括卵凝結(jié)、尾部畸形、脊椎側(cè)彎、卵黃囊異常、心跳停止等。仔魚孵化破膜后，失去了卵膜的保護，直接與毒環(huán)境接觸，這個階段通常被認為毒性敏感性提高，也是一個較好的觀察階段[10]。

原油中所含的多種有毒物質(zhì)會降低魚卵的孵化率，并能造成仔稚魚的變異、畸形甚至導(dǎo)致死亡，其濃度與其對魚類胚胎的毒性指標(biāo)均成正相關(guān)[11]。原油對孵化率的抑制作用可能來自其對胚胎內(nèi)酶分布的改變。

原油的水溶性成分(WAF)在2.02 mg/l時即對斜帶髭鯛受精卵的孵化有明顯抑制，并引起破膜仔魚畸形(短尾、糜爛、彎體)，所孵化出仔魚的畸變率有明顯的含量依賴性[12]。原油可引起前鱗鯔仔魚呼吸困難，體表粘膜受損，各鰭損傷糜爛。仔魚消化道中有細微油粒存在，隨著原油濃度的加大，油粒的數(shù)量也增多[13]。

原油可導(dǎo)致褐牙鲆仔稚魚鰓部發(fā)炎，仔魚的死亡時間普遍短于稚魚(24～48 h達到高峰)，并可表現(xiàn)出明顯的毒物蓄積癥狀[14]。原油毒性可在斑馬魚胚胎發(fā)育時造成卵凝結(jié)和尾部彎曲，引起仔魚焦躁、狂游、旋轉(zhuǎn)和抽搐等癥狀，嚴(yán)重時導(dǎo)致昏迷，并麻痹致死[15]。

幾種原油對幾種魚類的LC50毒性研究結(jié)果見表1。

1.4 致毒作用差異性和原理

原油毒性效應(yīng)因魚類種類不同而異，如在敏感性上，真鯛>牙鲆>黑鯛。很多試驗表明，經(jīng)濟魚類的仔魚敏感性要高于近岸的非經(jīng)濟魚類，這可能是由于經(jīng)濟魚類成魚體型大、生活于遠洋和較深的潔凈水體中，對毒物的耐受性不如近岸小型魚類。在同種魚類進行的試驗中，不同體型和不同溫度等因素也造成了結(jié)果差異。通常在溫度升高時，毒性影響增強，但由于胚胎孵化速度也隨著升溫而加快，導(dǎo)致破膜時間提前。如原油對真鯛胚胎孵化率的影響，在17℃時要比15℃ 時反而略有減弱[16]。

表1 原油對幾種魚類毒性的LC50

陳民山[14]認為，原油烴對胚胎的致畸作用有如下幾種可能：其中的苯等物質(zhì)導(dǎo)致了魚卵染色體異常；可溶性的芳香烴具有麻醉作用，造成了胚胎活力下降，破壞了胚胎發(fā)育過程中的能量動態(tài)平衡。魚類胚胎和仔魚期機體反饋系統(tǒng)發(fā)育程度的不同也造成了胚胎和仔魚對毒物敏感性的差異，所造成仔魚的亞急性效應(yīng)也同樣值得重視。

2 消油劑對魚類毒性的相關(guān)研究

2.1 消油劑造成了水環(huán)境的二次污染

消油劑對水環(huán)境的二次污染通常被認為來自兩個方面：一是其中含有的表面活性劑組分自身具有的毒性。Swedmark等將分散劑的96 hLC50毒性分為3級：1～100 mg/L為高毒；100～1000 mg/L為一般毒性；1000～10000 mg/L為微毒[17]。二是其乳化作用促進了低分子量烴類的溶解，使其生物利用率增加。乳化顆粒被認為可以透過鰓絲和血管等進入生物體內(nèi)，加大了油污對生物的毒性作用，并使得原油烴通過食物鏈影響到更多生物，延長了毒性存留的時間。有研究表明加入消油劑后，0號柴油對馬糞海膽的生物毒性增強[18]。

2.2 消油劑對魚類毒性影響的研究

高濃度的消油劑可造成水體渾濁，可見度降低。消油劑能影響魚類的味覺器官，不利于魚類的攝食和繁殖等生命活動[19]。消油劑對魚類呼吸器官的毒性不可逆轉(zhuǎn)，但對于神經(jīng)系統(tǒng)的毒性則能夠逆轉(zhuǎn)[20]。

同種消油劑對于不同的受試生物，毒性有所不同。裸項櫛蝦虎魚仔魚對GM-2消油劑的毒性敏感性高于鹵蟲幼體和凡納濱對蝦仔蝦，但低于蒙古裸腹蚤Ⅰ齡幼體[21]。楊渡關(guān)等的研究也表明，不同品種的消油劑對阿匍鰕虎魚的毒性差異很大，Correxit 9527的毒性遠大于雙象I號等微毒性消油劑[22]。

溢油污染多發(fā)于海面，因此對消油劑作用研究多以海水環(huán)境為主。在自然環(huán)境中，較高的溫度有利于消油劑發(fā)揮作用，在25℃時最佳；提高劑油比也利于乳化，但高于20%則反而效率降低[23]。也有一些試驗研究了常用的幾種分散劑對淡水魚類的毒性作用，為其在鹽度較低的河口或內(nèi)河流域的使用起到了參考作用[24]。過低的鹽度對消油劑的乳化率有極大的影響。在其他實驗條件一致的條件下，鹽度為33海水的乳化率為58，而鹽度為0時，水的乳化率僅為1[25]，因此，通常認為消油劑不適于用在內(nèi)河等低鹽度的水域。

幾種消油劑對幾種魚類的LC50毒性研究結(jié)果見表2。

2.3 消油劑和原油聯(lián)合作用影響的研究

關(guān)于消油劑和原油的聯(lián)合作用，目前進行的研究較少，爭議也較大。這是由于海水環(huán)境情況復(fù)雜、原油種類較多而消油劑對原油具有選擇性等原因造成，實驗室模擬狀態(tài)下提供的結(jié)果和實際情況往往有所不同。有觀點認為，消油劑的乳化作用使原油乳化為幾微米的顆粒，導(dǎo)致魚類暴露在分散態(tài)的原油中。這些顆粒可進入水生生物體內(nèi)發(fā)生作用，從而加大了油污的毒害作用。

在靜水環(huán)境下，相同濃度下的原油-消油劑的混合液比單獨消油劑或原油溶液影響要大得多。這是因為水體小，交換差，水體中的部分原油被乳化而不能隨水?dāng)U散，再加上消油劑自身的毒性，導(dǎo)致反而加重了原油的危害程度[26]。但在對Corexit 9527的研究(Gulec， 1997)中發(fā)現(xiàn)，在原油水溶性成分中添加消油劑后，對生物的半致死濃度大為降低[27]。

3 研究展望

3.1 消油劑未來發(fā)展趨勢

通過大量的魚類毒性實驗，人們得以了解消油劑自身毒性的作用方式和發(fā)生條件，促進了濃縮型和低溫型等新型產(chǎn)品的研發(fā)，并有助于在事故中確定分散劑使用的種類和用量，從而盡量避免乳化率低、水體DO值驟變或無法順利擴散等二次污染。海洋中生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜，不同的生態(tài)系、不同生物、不同生命階段、不同環(huán)境因子均會引起生物對原油烴的不同敏感度。精確合理的使用消油劑，有利于保護生態(tài)系中脆弱的環(huán)節(jié)，降低原油烴在食物鏈中的富集。

表2 消油劑對幾種魚類毒性的LC50

3.2 實驗用魚類的開發(fā)進展

除斑馬魚外，目前國外已經(jīng)成功培育虹鳉、亞馬孫鳉、新月魚等純系；國內(nèi)即將建成的有劍尾魚、稀有鮈鯽和紅鯽等。這些魚類實驗動物被分別應(yīng)用于衰老、致癌機制、內(nèi)分泌學(xué)、水生生態(tài)毒理學(xué)研究以及作為藥物的生物檢定材料[6]。中國2004年頒布的新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則規(guī)定，新化學(xué)物質(zhì)的基礎(chǔ)水平申報材料所使用水生生物急性毒性試驗數(shù)據(jù)中首選魚類實驗數(shù)據(jù)。在OECD高產(chǎn)量化學(xué)品計劃(HPV)中，急性魚類毒性試驗是一項基本要求，除了96 hLC50，還有魚類14 d延長毒性試驗、魚類早期生活階段毒性試驗、魚類胚胎一卵黃囊吸收階段的短期毒性試驗、魚類幼體生長試驗等一系列試驗[9]。

盡管計算機模擬等生物試驗替代技術(shù)有所發(fā)展，但在原油和消油劑的毒性研究領(lǐng)域中，魚類試驗(包括魚細胞系和魚胚胎試驗)因其簡單方便的實驗條件、可控的遺傳家系和明確及結(jié)果便于分析等優(yōu)點，依然作為基本研究方法而長期占據(jù)重要的地位。用于毒性試驗的胚胎品種發(fā)育過程時間短，便于觀察和控制。染毒后可分析其作用時間、死亡率、致畸性等多項指標(biāo)，和成本相對較高的成魚急性毒性試驗相比，具有很大的優(yōu)勢[28]。歐洲化學(xué)品毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)中心(ECETOC)也提出用細胞系和魚胚胎試驗來替代標(biāo)準(zhǔn)魚類毒性實驗[9]。

在今后的環(huán)境毒理學(xué)研究中，應(yīng)當(dāng)繼續(xù)加強實驗魚類純化基因品系的建立，進行更多的基因測序，并拓展眼界，從更多的品種中篩選出體型和敏感度適宜的品種來豐富實驗動物的選擇范圍，并從其功能性上加以更細致的劃分。在毒性試驗方面，應(yīng)對不同毒性指標(biāo)進行深入分類和原理探討，除了死亡這種污染晚期效應(yīng)外，致畸和理化指標(biāo)、臟器病變、酶活性變化等早期指標(biāo)也應(yīng)受到進一步重視。

3.3 原油和消油劑相關(guān)毒性試驗展望

在原油工業(yè)長足發(fā)展的今天，原油污染及其解決辦法是水環(huán)境毒理學(xué)的重要研究課題之一。目前，用于研究的實驗動物魚種多為淡水魚類，用于咸水或海水環(huán)境的魚種并不多。除了大型經(jīng)濟魚類的胚胎和幼魚外，一些適用于實驗室保存和繁殖的小型海水魚現(xiàn)在也得到了重視和研究，如裸項櫛蝦虎魚的人工繁育已到第6代，對其人工繁殖和生理研究積累了較多的研究成果。

由于海洋環(huán)境的極端復(fù)雜性，相關(guān)毒性試驗有必要優(yōu)化和細化，以期在試驗環(huán)境上能真實模擬溢油現(xiàn)場。原油和消油劑在水體中的轉(zhuǎn)化、沉降等動力學(xué)特征和化學(xué)反應(yīng)應(yīng)得到進一步研究。其毒性對魚類的影響的具體機理目前尚不清楚，引起酶活性的變化和染色體變異等微觀生物學(xué)效應(yīng)是有待發(fā)展的新興領(lǐng)域。

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