鳳 權(quán)， 魏安靜， 侯大寅, 武丁勝

(1. 安徽工程大學(xué) 紡織面料安徽省高校重點實驗室， 安徽 蕪湖 241000；2. 安徽工程大學(xué) 安徽省電氣傳動與控制重點實驗室， 安徽 蕪湖 241000)

粘桿菌素又名多粘菌素E(Polymyxin E)、克里斯汀(Colistin)等，對革蘭氏陰性菌有很好的抗菌效果，幾乎無殘留，是最安全的獸用抗生素之一[1-2]。膜分離技術(shù)是迅速發(fā)展的現(xiàn)代分離濃縮技術(shù)，操作條件溫和，無需添加試劑，尤其適用于易變性的熱敏性物質(zhì)的分離純化[3]。筆者在前期的研究中，曾經(jīng)利用陶瓷膜對粘桿菌素進行微濾處理，并利用聚醚砜(PES)超濾膜對發(fā)酵液進行超濾處理，取得良好的效果[4-5]。

靜電紡絲技術(shù)是制備納米纖維的有效途徑[6-10]。本研究采用靜電紡絲制得聚丙烯腈(PAN)納米纖維，再通過化學(xué)改性在納米纖維表面引入偕胺肟基團制成偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)納米纖維，將AOPAN納米纖維膜作為分離層，構(gòu)建膜分離系統(tǒng)，對粘桿菌素發(fā)酵液進行膜分離處理，以期在確保良好濾過效果的基礎(chǔ)上，利用AOPAN納米纖維膜的高孔隙率和親水性有效提高膜的通量與抗污染能力。論文中，系統(tǒng)分析了AOPAN納米纖維膜對粘桿菌素發(fā)酵液的分離性能，為納米纖維應(yīng)用于抗生素發(fā)酵液后處理提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

聚丙烯腈(PAN，Mw=79100 g/mol)，購于Sigma-Aldrich公司；N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、鹽酸羥氨、考馬斯亮藍(lán)(G-250)購于國藥化學(xué)試劑有限公司；試驗中所有藥品皆為分析純，使用前未經(jīng)進一步純化。

實驗用粘桿菌素發(fā)酵液(經(jīng)過預(yù)處理)：發(fā)酵液由安徽皖北藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)過硫酸酸化，pH值約5.0，再經(jīng)陶瓷膜(管式，0.2 μm 孔徑)微濾預(yù)處理，效價為8.25×104U/mL，蛋白質(zhì)含量：53 mg/100 mL，吸光度為0.358。

比表面積及孔徑測試儀(金埃譜，F(xiàn)-sorb2400)；MSC300杯式過濾杯(杯體為有機玻璃)，購于上海摩速科學(xué)器材有限公司；自制靜電紡絲裝置(主要包括注射器、注射泵、高壓直流電源、納米纖維收集裝置)。粘桿菌素效價測定所需的器材見《中華人民共和國藥典》(2005版)，附錄ⅪA (抗生素抗生素微生物鑒定法)

1.2 實驗方法

1.2.1AOPAN納米纖維的制備

將干燥后的PAN粉末溶解到DMF 中，連續(xù)攪拌至完全溶解，制得質(zhì)量百分比10%的紡絲液。將紡絲液加入到容量為20 mL的注射器中(配備內(nèi)徑為0.7 mm的不銹鋼針頭，并磨平)，高壓直流電源正極與注射器的針頭連接，用鋁箔接收納米纖維(接收板與地線相連)。紡絲電壓設(shè)置為18 kV，紡絲接收距離為18 cm，紡絲液的噴射速度設(shè)置為1.2 mL/h。連續(xù)收集36 h后，將纖維膜于真空干燥箱中40 ℃干燥。

將制得的PAN 納米纖維膜(約0.2 g/份)加入到100 mL pH值為7.0濃度為0.5 mol/L 的鹽酸羥氨水溶液中(酸堿度用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié))，在70 ℃下反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌納米纖維至中性后于40℃真空干燥，以備用。用氰基的轉(zhuǎn)化率來體現(xiàn)胺肟化反應(yīng)進行程度，具體按照文獻[11]計算。

1.2.2 膜分離裝置的構(gòu)建

為分析不同厚度的納米纖維膜的過濾性能，分別將單層、兩層、三層AOPAN納米纖維膜疊合作為分離膜(經(jīng)測定，納米纖維膜的BET比表面積為20.4 m2/g, 孔體積為0.04 mL/g, 平均孔徑為 12.6 nm；單層納米纖維膜的面密度約2.5 mg/cm2)。膜分離設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，將單層或疊合的多層分離膜放置于過濾器的杯體和底座之間，以尼龍導(dǎo)流網(wǎng)作為支撐層，用不銹鋼卡箍固定。

1.2.3 分離膜厚度的選擇及膜分離性能研究

圖1 基于納米纖維膜分離裝置結(jié)構(gòu)示意圖

1—濾料入口; 2—氮氣入口; 3—納米纖維膜；4—尼龍導(dǎo)流網(wǎng); 5—濾過液出口; 6—經(jīng)微濾處理后的粘桿菌素發(fā)酵液。

研究中，分別測定不同層數(shù)的AOPAN納米纖維膜的滲透通量，每次操作時間為160 min；壓力設(shè)置為0.1 MPa；磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 rad/min。根據(jù)測試結(jié)果，選擇適宜的分離膜層數(shù)。以經(jīng)過陶瓷膜微濾預(yù)處理的粘桿菌素發(fā)酵液作為待過濾液，發(fā)酵液的微濾預(yù)處理與我們前期的研究方法相同[4]。膜通量用單位時間內(nèi)通過單位膜面積的溶液體積來表示通量，具體見式1。

(1)

式中：J—通量(L/m2·min)；

V—濾過液的體積(L)；

S—膜的有效面積(m2)；

t一操作時間(min)

在研究膜的通量的過程中，同時測定蛋白質(zhì)的截留率和透過液中粘桿菌素的含量(粘桿菌素A分子量為1169，粘桿菌素B分子量為1155)，在保證蛋白質(zhì)較高截留率的基礎(chǔ)上，兼顧生產(chǎn)效率，選擇最適膜層數(shù)。透過液中蛋白質(zhì)的截留率按式2計算：

(2)

式中，R—蛋白質(zhì)的截留率；

C0—發(fā)酵液(經(jīng)過預(yù)處理)中蛋白質(zhì)的濃度 (mg/mL)；

Cp—濾過液中蛋白質(zhì)的濃度 (mg/mL)

另外，為探討操作壓力對膜分離性能的影響，將膜分離的操作壓力從0.04 MPa開始，每5 min提高0.02 MPa，直至升高到0.16 MPa，研究操作壓力對納米纖維膜的通量和對蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)截留率的影響。

上述幾項實驗過程中，每當(dāng)過濾杯中發(fā)酵液濃縮8倍后將排出，并重新補充預(yù)處理后的發(fā)酵液。考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量[12]；粘桿菌素生物效價按照藥典規(guī)定的“二劑量法”來測定[13]；濾過液吸光度利用紫外可見發(fā)光光度計在470 nm處測得(蒸餾水作為空白)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米纖維膜厚度對膜滲透通量的影響

將不同層數(shù)的AOPAN納米纖維膜在相同的壓力(0.1 MPa)條件下測定其滲透通量，平行實驗3次，計算標(biāo)準(zhǔn)差。實驗結(jié)果如圖2。

圖2 不同納米纖維膜的滲透通量(操作壓力為0.1MPa)

可以看出，單層和雙層納米纖維膜維持較高的滲透通量，三層納米纖維膜的滲透通量大幅下降。式(3)可以用于分析研究納米纖維膜通量與濃差極化之間的關(guān)系。

(3)

式中，J—膜的滲透通量，k—傳質(zhì)系數(shù)，cw—膜表面濃差極化層溶質(zhì)濃度，c0—溶液的溶質(zhì)濃度。

3種納米纖維膜隨著操作時間的延長，其膜通量都在逐漸下降，這主要由于隨著膜分離過程的進行，部分蛋白質(zhì)、色素、膠體等吸附在納米纖維膜表面，并逐漸形成濃差極化層[14]。

根據(jù)納米纖維膜的滲透通量結(jié)果，利用式4可計算出膜通量的衰減系數(shù)。

Jt=J1·t-m

(4)

式中，Jt，J1—分別為納米纖維膜運行t小時和1小時后的通量 (L/m2.min)、t—系統(tǒng)運轉(zhuǎn)時間(h)、m—膜通量衰減系數(shù)。

表1不同厚度納米纖維膜的通量衰減系數(shù)

從表1可以看出，在同樣的條件下，隨著納米纖維膜層數(shù)的增加，其通量衰減系數(shù)也逐漸增大，當(dāng)層數(shù)達(dá)到三層的時候，通量衰減系數(shù)大幅上升。衰減系數(shù)小，將有助于納米纖維膜的穩(wěn)定運行。

2.2 納米纖維膜厚度與膜分離性能的關(guān)系

對不同層數(shù)的AOPAN納米纖維膜在相同的壓力(0.1 MPa)條件下得到的濾液成分進行分析。實驗結(jié)果見圖3和表2。

圖3 納米纖維膜對發(fā)酵液蛋白質(zhì)的截留率(操作壓力為0.1MPa)

將160 min內(nèi)收集的濾液進行分析，得出其蛋白質(zhì)截留率及吸光度數(shù)值，具體見表2。

表 2 不同納米纖維膜的蛋白質(zhì)平均去除率及濾液吸光度

根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，不同厚度的納米纖維膜對蛋白質(zhì)的截留率有較大差異，在相同操作條件下，疊合的纖維膜達(dá)到2層以上時，體現(xiàn)出良好的蛋白質(zhì)截留性能。通過對濾過液的生物效價測定，粘桿菌素均能通過上述3種不同厚度的納米纖維膜，對得率不造成損失。

透光度主要體現(xiàn)濾液中雜質(zhì)和色素的多少，會影響最終產(chǎn)品的純度。結(jié)果表明，濾過液的吸光度是隨膜厚度的增大而減小，膜厚為兩層時，吸光度已經(jīng)低于0.2，該數(shù)據(jù)優(yōu)于用PES超濾膜的處理結(jié)果 (與PES超濾膜相比，兩層疊合納米纖維膜的滲透通量也有大幅提高)[5]，這意味著更多的雜質(zhì)被納米纖維膜截留，最終粘桿菌素產(chǎn)品將會有更高的純度。

綜合分析納米纖維膜的滲透通量、衰減系數(shù)，以及濾過液的蛋白質(zhì)截留率和吸光度可得出，雙層疊合的納米纖維膜過濾性能理想、過程穩(wěn)定，具有潛在的實際應(yīng)用價值。

2.3 操作壓力與納米纖維膜分離性能的關(guān)系

操作壓力不僅是影響納米纖維膜滲透通量的重要因素，其對膜分離性能也有影響。對于膜分離裝置而言，在運行過程中，既需要保證對蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)較高的截留率，又要盡量提高其處理效率。實驗中，利用雙層疊加的AOPAN納米纖維膜對粘桿菌素發(fā)酵液進行膜分離，在不同的操作壓力下，測定納米纖維膜的滲透通量以及蛋白質(zhì)的截留率。

圖3 操作壓力對納米纖維膜分離性能的影響

可以看出，在膜分離的初期階段，壓力較低，膜的滲透通量也較低，此時的過濾阻力主要來自于膜本身；隨著操作壓力的逐漸加大，膜的滲透通量也迅速增加，也加快了納米纖維膜表面凝膠層的形成，并逐漸出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，通量增加幅度變緩；當(dāng)壓力達(dá)到0.14 MPa時，增加的壓力幾乎都被凝膠層阻力所抵消。另外，當(dāng)壓力大于0.14 MPa以后系統(tǒng)變的不太穩(wěn)定，當(dāng)壓力大于0.16 MPa后，納米纖維膜出現(xiàn)破損。

實驗同時測定了在不同的操作壓力下納米纖維膜對蛋白質(zhì)截留率。結(jié)果表明，在整個膜分離過程中，操作壓力對蛋白質(zhì)截留率沒有顯著影響。綜合上述實驗結(jié)果，選擇0.14 MPa作為該膜分離系統(tǒng)的最適操作壓力(該階段濾過液的蛋白質(zhì)含量為5.32 mg/100 mL，通量為2.61 L /m2.min，吸光度為0.189)。

3 結(jié)論

本文經(jīng)過靜電紡絲及化學(xué)改性制得直徑為納米尺度的AOPAN功能性納米纖維，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建膜分離系統(tǒng)，用于粘桿菌素發(fā)酵液的后處理。通過對不同厚度的納米纖維分離膜的傳質(zhì)及分離性能對比，確定雙層疊合的AOPAN納米纖維膜為適宜厚度。實驗結(jié)果同時表明，基于雙層AOPAN納米纖維的分離膜具有較高的滲透通量，對發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)有良好的截留性能，而對粘桿菌素的得率不造成影響。本文還同時研究量在不同操作壓力下，納米纖維膜的通量變化和分離效果，結(jié)果表明，0.14 MPa為最適操作壓力，在此條件下，納米纖維膜的通量為2.61 L/m2.min，蛋白質(zhì)的截留率達(dá)到90%，吸光度降為0.189，色素等其他雜質(zhì)也得到有效去除。該研究為納米纖維應(yīng)用于抗生素發(fā)酵液后處理提供實驗依據(jù)。

參考文獻：

[1]Nasnas R, Saliba G, Hallak P. The revival of colistin: An old antibiotic for the 21st century[J]. PathologieBiologie, 2009, 57(3): 229-235.

[2]王 旭, 向文良, 馮 瑋. 多黏菌素E研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 16(1): 24-25.

[3]Hassan M A, Yeom B Y, Wilkie A, et al. Fabrication of nanofiber melt blown membranes and their filtration properties[J]. J Membr Sci, 2013, 427: 336-344.

[4]鳳 權(quán), 湯 斌. 粘桿菌素發(fā)酵液微濾膜分離處理過程研究[J]. 生物學(xué)雜志, 2010, 27(1): 43-46.

[5]魏安靜，田 麗，鳳 權(quán). 基于聚醚砜(PES)超濾膜的粘桿菌素發(fā)酵液預(yù)處理過程優(yōu)化 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(10): 88-91.

[6]Yu D G, Chian W, Wang X, et al. Linear drug release membrane prepared by a modified coaxial electrospinningprocess[J]. Journal of Membrane Science, 2013, 428: 150-156.

[7]Lu P, Hsieh Y L. Lipase bound cellulose nanofibrous membrane via cibacron blue F3GA affinity ligand [J]. Journal of Membrane Science, 2009, 330: 288-296.

[8]Feng Q, Wei Q F, Hou D Y, et al. Preparation of amidoxime polyacrylonitrile nanofibrous membranes and their applications in enzymatic membrane reactor [J]. Journal of Engineered Fibers and Fabrics, 2014, 9(2) :146-152.

[9]Feng Q, Wang Q Q, Tang B, et al. Immobilization of catalases on the amidoxime polyacrylonitrile nanofibrous membranes [J]. Polymer International, 2013, 62(2): 251-256.

[10]Zhao Y, Sun L, Xi M, et al. Electrospun TiO2nanofelt surface-decorated with Ag nanoparticles as sensitive and UV-cleanable substrate for surface enhanced raman scattering [J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014(6): 5759-5767.

[11]Feng Q, Wang X Q, Wei A F, et al. Surface modified ployacrylonitrile nanofibers and application for metal ions chelation [J]. Fibers and Polymers, 2011, 12(8): 1025-1029.

[12]Feng Q, Tang B, Wei Q F, et al. Preparation of a Cu(II)-PVA/PA6 composite nanofibrous membrane for enzyme immobilization [J] . International Journal of Molecular Sciences. 2012 (13): 12734-12746.

[13]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005，附錄ⅪA抗生素微生物檢定法.

[14]Giorno L, Amore E D, Mazzei R. Aninnovative approach to improve the performance of a two separate phase enzyme membrane reactor by immobilizing lipase in presence of emulsion [J]. Journal of Membrane Science, 2007, 295: 95-101.