陳元元, 吳 巖, 劉曉光

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212003)

乙偶姻的化學(xué)名為3-羥基-2-丁酮(CH3COCHOHCH3)，又名甲基乙酰甲醇，是一種廣泛使用的化合物，同時(shí)也是多種微生物的次生代謝產(chǎn)物。易燃，易揮發(fā)，易溶于水、混溶于乙醇，微溶于醚、石油醚。它具有令人愉悅的奶油香味，可用于奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生產(chǎn)[1-3]。乙偶姻作為一種重要的平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、生物燃料等行業(yè)。目前實(shí)驗(yàn)室制備乙偶姻主要有從含乙偶姻的植物中提取以及微生物法和化學(xué)合成法。其中微生物法因原料可再生、反應(yīng)條件溫和而備受關(guān)注。

1 微生物乙偶姻的合成及分解代謝

在自然界中，許多微生物在糖酵解過程中能夠?qū)⑻穷愞D(zhuǎn)化為乙偶姻來避免酸中毒[4-5]。乙偶姻的產(chǎn)生伴隨著副產(chǎn)物2, 3-丁二醇、2, 3-丁二酮、乙酸、乳酸等有機(jī)酸。乙偶姻在丁二醇脫氫酶作用下可逆地轉(zhuǎn)換成2, 3-丁二醇或在丁二酮還原酶作用下可逆轉(zhuǎn)換成2, 3-丁二酮。

1.1 微生物乙偶姻的合成代謝

在自然界中有許多微生物能夠合成乙偶姻和2, 3-丁二醇，研究較多的主要包括克雷伯氏菌屬(Klebisella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)以及氣單胞菌屬(Aeromonas)等[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物合成乙偶姻途徑需要經(jīng)歷兩個(gè)酶的催化，分別為α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脫羧酶。糖類物質(zhì)經(jīng)糖酵解途徑合成丙酮酸，兩分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下生成乙酰乳酸和二氧化碳，隨后乙酰乳酸經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶脫羧作用合成乙偶姻[4, 10]。微生物合成乙偶姻的途徑如圖1所示。

圖1 微生物合成乙偶姻的途徑

1—糖酵解途徑；2—丙酮酸脫氫酶系；3—α-乙酰乳酸合成酶；4—α-乙酰乳酸脫羧酶；5—2, 3-丁二醇脫氫酶；6—2, 3丁二酮還原酶。

乙偶姻合成基因以操縱子的形式存在。Pieter Moons[11]等人發(fā)現(xiàn)在普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)RVH1中，其合成途徑和調(diào)控基因由一LysR型調(diào)控因子budR、結(jié)構(gòu)基因budA(編碼α-乙酰乳酸合成酶)、budB(編碼α-乙酰乳酸脫羧酶)和budC(編碼2, 3-丁二醇脫氫酶)組成。budA和budB形成一個(gè)操縱子，和budR之間間隔382 bp。Renna[12]等人通過對Bacillussubtilis的研究發(fā)現(xiàn)乙偶姻合成和調(diào)控基因包括：alsS(編碼α-乙酰乳酸合成酶)、alsD(編碼α-乙酰乳酸脫羧酶)和alsR(編碼LysR型調(diào)控子)。alsS和alsD屬于一個(gè)操縱子，alsR與alsSD操縱子的轉(zhuǎn)錄方向相反。Vibriocholerae乙偶姻合成基因與Bacillussubtilis的相似[13]。粘滯沙雷氏菌(Serratiamarcescens)乙偶姻合成基因包括slaA(編碼α-乙酰乳酸合成酶)、slaB(編碼α-乙酰乳酸脫羧酶)和slaC(編碼2, 3-丁二醇脫氫酶)。與Klebsiellasp,Klebsiellapneumonie,Vibriosp和Vibriocholerae不同，Serratiamarcescens的slaC與其他基因分隔開[14]。

1.2 微生物乙偶姻的分解代謝

乙偶姻是廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中的食用香料，在微生物發(fā)酵過程中伴隨2, 3-丁二醇合成代謝過程中產(chǎn)生[15-17]。2, 3-丁二醇是一種重要的生物類化學(xué)品，廣泛用于化工、食品、航空航天燃料等領(lǐng)域，可用來制備聚合物、油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、藥物手性載體等[18-19]。

在Clostridiummagnum，Klebsiellapneumoniae，Pectobacteriumcarotovorum，Pseudomonasputida，Bacillussubtilis，Pelobactercarbinolicus和Alcaligeneseutrophus細(xì)菌中，乙偶姻的分解代謝由羥基丁酮脫氫酶酶系(AoDH ES)催化完成，包括：焦磷酸硫胺素依賴型的羥基丁酮脫氫酶(AoDH E1)、二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(AoDH E2)和二氫硫辛酰胺乙酰脫氫酶(AoDH E3)[20， 21]，AoDH ES的結(jié)構(gòu)基因acoA、acoB、acoC線性依次排列于染色體上[21-25]，在P.carbinolicus，K.pneumoniae和C.magnum中的acoL基因也屬于aco基因簇。而Huang等[26]通過研究則提出不同觀點(diǎn)，他認(rèn)為由acu基因簇編碼枯草芽孢桿菌分解羥基丁酮的酶。

Klebsiellapneumoniae是一種廣泛研究并應(yīng)用于工業(yè)化產(chǎn)生2, 3-丁二醇的菌株。在K.pneumoniae的碳代謝過程中，有3種非常重要的酶控制2, 3-丁二醇的合成路徑，乙酰乳酸脫羧酶，乙酰乳酸合成酶，2, 3-丁二醇脫氫酶分別為基因budA,budB和budC所編碼。這3種酶在2, 3-丁二醇和細(xì)胞生長中的功能和作用機(jī)制已經(jīng)研究出來了。很多研究都集中在這3種酶的合作機(jī)制和相互影響上。對K.pneumoniaeKCTC2242::ΔwabG菌株對這3種酶進(jìn)行單突變，雙突變，三突變，過表達(dá)的研究表明，過表達(dá)菌株2, 3-丁二醇產(chǎn)量增加。budBA過表達(dá)產(chǎn)量增加最多。budA基因編碼的乙酰乳酸脫羧酶的支鏈氨基酸有利于細(xì)胞生長，budB基因編碼的乙酰乳酸合成酶以一種氧氣依賴的方式增強(qiáng)乙酰乳酸轉(zhuǎn)換成乙偶姻，budC基因編碼的2, 3-丁二醇脫氫酶催化乙偶姻和2, 3-丁二醇之間的可逆反應(yīng)并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH的平衡[27]。

2 乙偶姻合成與分解代謝的調(diào)控

2.1 乙偶姻合成調(diào)控

在普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)RVH1和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)中，budR編碼LysR型調(diào)控因子，此調(diào)控子能夠激活budAB結(jié)構(gòu)操縱子，而budR自身負(fù)調(diào)控。另外一些外部刺激物如群體感應(yīng)信號(hào)分子和醋酸鹽正調(diào)控budR。群體感應(yīng)信號(hào)分子和醋酸鹽正調(diào)控對budR轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)不需要budR，表明在環(huán)境信號(hào)分子對budR啟動(dòng)子的作用中還涉及到其他的調(diào)控子[11]。

在Serratiamarcescens合成乙偶姻的過程中， LuxR型的調(diào)控因子SwrR和LysR型調(diào)控因子SlaR調(diào)控slaA和slaB的轉(zhuǎn)錄但不影響slaC的表達(dá)。通過過表達(dá)alsSD操縱子增加α-乙酰乳酸合成酶量能夠提高乙偶姻產(chǎn)量；另外，通過敲除bdhA、acoA、pta阻斷乙偶姻降解以及競爭合成路徑能夠提高乙偶姻產(chǎn)量[8]。

Renna[12]對Bacillussubtilis乙偶姻合成基因調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，若alsR基因突變，alsSD操縱子則不能表達(dá)。alsS和alsR轉(zhuǎn)錄融合分析表明alsSD操縱子的轉(zhuǎn)錄需要AlsR參與，AlsR在穩(wěn)定期表達(dá)量增加。此外，pH值的下降也可能是激活alsS轉(zhuǎn)錄的一個(gè)條件[1]。Andrew[1]等人研究發(fā)現(xiàn)CcpA蛋白能調(diào)控枯草芽孢桿菌乙偶姻合成基因的表達(dá)。CcpA是一些結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的保守cre位點(diǎn)LacI/GalR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。在部分調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的Hpr/Crh信號(hào)通路中CcpA作為抑制子阻止細(xì)胞利用第二碳源。另外當(dāng)枯草芽孢桿菌生長于葡萄糖培養(yǎng)基時(shí)激活碳分泌路徑包括乙偶姻分泌途徑需要CcpA。但是alsSD操縱子沒有cre位點(diǎn)，另外醋酸鹽也能夠增加alsSD的轉(zhuǎn)錄，表明CcpA對alsSD的影響是間接的。CcpA調(diào)控渠道可能是依賴于ack/pta路徑積累的醋酸鹽來調(diào)控alsSD的表達(dá)。

Kovacikova等人[13]研究發(fā)現(xiàn)在Vibriocholerae中，在群體密度比較低時(shí)，群體感應(yīng)調(diào)控激活子AphA抑制乙偶姻合成基因表達(dá)，可達(dá)15倍。普里斯考爾實(shí)驗(yàn)(Voges Proskauer test, V-P實(shí)驗(yàn))表明，在非誘導(dǎo)表達(dá)的條件下，刪除AphA能夠提高乙偶姻的產(chǎn)量。LysR型調(diào)控因子AlsR也是乙偶姻合成所必需的。

2.2 乙偶姻分解代謝的調(diào)控

在葡萄糖缺乏的情況下BacilluslicheniformisDSM13的acoABCL和acuABC操縱子在轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)增強(qiáng)。引物延伸分析表明acoABCL操縱子受σL依賴型的啟動(dòng)子控制，acuABC操縱子受σA依賴型的啟動(dòng)子控制。當(dāng)碳源葡萄糖枯竭時(shí)葡萄糖抑制acoA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄而乙偶姻誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。acuA啟動(dòng)子具有相似的誘導(dǎo)模式但是它的活性不依賴于乙偶姻的存在。這些表明acoABCL操縱子主要負(fù)責(zé)B.licheniformis中乙偶姻和2, 3-丁二醇的降解[28]。

Bacillussubtilis中存在丁二醇循環(huán)。醋酸是這個(gè)循環(huán)反應(yīng)的終產(chǎn)物，丙酮轉(zhuǎn)換成兩分子的醋酸，外界條件對這個(gè)功能循環(huán)的酶的合成有很大影響。乙偶姻刺激乙偶姻脫氫酶和二乙酰甲基甲醇合酶合成。葡萄糖通過阻遏酶的分解代謝物來對抗這種影響。二乙酰甲基甲醇合酶，丁二醇脫氫酶和二乙酰還原酶與以上兩種分解代謝物誘導(dǎo)的酶形成對比。乙偶姻沒有任何調(diào)控效應(yīng)。從乙偶姻生成二乙酰的反應(yīng)是由一種酶—乙偶姻脫氫酶完成的，葡萄糖誘導(dǎo)二乙酰還原酶并阻遏乙偶姻脫氫酶，乙偶姻誘導(dǎo)乙偶姻脫氫酶的合成但并不影響二乙酰還原酶[29]。

由于乙偶姻是許多微生物分泌一種重要的生理代謝分泌物，乙偶姻的分泌，能夠通過V-P實(shí)驗(yàn)檢測出并可作為一種微生物分類標(biāo)志，對微生物有著重要的生理意義，主要包括避免酸中毒，參與調(diào)解NAD+/NADH的比率，儲(chǔ)存碳源。乙偶姻合成代謝涉及α-乙酰乳酸合成酶，α-乙酰乳酸脫羧酶。盡管這些比較受關(guān)注而且已經(jīng)做了很多研究了，然而乙偶姻代謝機(jī)制還包含不同的觀點(diǎn)，Current發(fā)現(xiàn)分解代謝物控制蛋白A(CcpA)調(diào)節(jié)的碳降解物阻遏可能提供一個(gè)合理的細(xì)菌中的控制機(jī)制[30]。到目前為止，這是細(xì)菌中的乙偶姻機(jī)制的第一個(gè)整合觀點(diǎn)，尤其是降解方面。細(xì)菌中乙偶姻的異化有利于提供一個(gè)更好的對微生物爭奪資源的策略，從而能更好的利用這些微生物。

3 乙偶姻代謝的生理意義

3.1 維持pH值穩(wěn)定

細(xì)菌將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻或2, 3-丁二醇，可以避免丙酮酸和乙酸等酸性產(chǎn)物在胞內(nèi)的過量積累[31-32]，從而維持pH值的穩(wěn)定，也避免了菌體的過早衰亡。

3.2 作為貯存碳源

當(dāng)葡萄糖等碳源物質(zhì)利用完之后，乙偶姻可以作為替代的能源或碳源[33]，所以在細(xì)菌體內(nèi)乙偶姻和2, 3-丁二醇可作為貯存碳源[34-35]。

3.3 維持NAD+/NADH的平衡

乙偶姻和2, 3-丁二醇之間的相互轉(zhuǎn)化是和NAD+與NADH之間的轉(zhuǎn)化相偶聯(lián)的，因此乙偶姻/2, 3-丁二醇代謝途徑也作為維持細(xì)菌體內(nèi)NAD+/NADH平衡的策略[35-36]。

4 乙偶姻的應(yīng)用及市場前景

4.1 植物保護(hù)方面的應(yīng)用

乙偶姻廣泛存在于許多植物中，如玉米、可可、葡萄、擬南芥、菊芋等。乙偶姻對這些植物的正常生長有著非常重要的作用。近些年研究表明乙偶姻具有誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，促進(jìn)植物生長的作用，在植物保護(hù)方面有著重要作用。

Cho[37]等人發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，植物根際促生菌PseudomonaschlororaphisO6誘導(dǎo)擬南芥對其他生物和外界環(huán)境壓力的耐受性。耐旱性與根際促生菌P.chlororaphisO6寄生的擬南芥關(guān)閉氣孔減少水分蒸發(fā)有關(guān)，并受氣孔孔徑以及氣孔關(guān)閉的百分比調(diào)控。氣孔關(guān)閉及耐旱性受乙偶姻調(diào)節(jié)。乙偶姻是P.chlororaphisO6的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物通過對擬南芥突變株的研究表明對干旱的耐受性需要水楊酸，乙烯以及茉莉酸的信號(hào)通路，同時(shí)誘導(dǎo)耐旱性和氣孔關(guān)閉依賴于脫落酸受體-1和氣孔開放因子-1，水楊酸信號(hào)誘導(dǎo)耐旱性。研究表明細(xì)菌產(chǎn)生的乙偶姻通過水楊酸依賴性的機(jī)制誘導(dǎo)擬南芥耐旱性。

植物根際促生菌賦予植物免疫力使植物能夠?qū)挂恍┤~病， 根際促生菌通過激活植物防御系統(tǒng)來減少植物對病原菌侵襲的易感性。在擬南芥中，乙偶姻誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)保護(hù)植物抵御疾病。把擬南芥(Col-0)置于枯草芽孢桿菌FBI7中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與沒用FBI7處理的對照組相比發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組擬南芥感染Pseudomonassyringaetomato DC3000的嚴(yán)重程度明顯減弱?？莶菅挎邨U菌外源性應(yīng)用產(chǎn)生出誘導(dǎo)子乙偶姻，乙偶姻引發(fā)植物系統(tǒng)抗性并保護(hù)植物抵御DC3000病原菌。此外，枯草芽孢桿菌乙偶姻合成突變株乙偶姻合成減少導(dǎo)致擬南芥抵御病原菌侵染的能力減弱。通過對FBI7和擬南芥防御缺失突變株的進(jìn)一步分析表明DC3000耐受性通過NPRI路徑發(fā)生并需要水楊酸(SA)/乙烯(ET)而不需要茉莉酸(JA)[38-39]。

植物根際促生菌產(chǎn)生乙偶姻還有增加植物產(chǎn)量的作用，通過對辣椒苗的研究表明細(xì)菌內(nèi)生菌對辣椒苗有促進(jìn)生長和抵御病原菌的作用，其中Pseudomonasrhodesiae和Pantoeaananatis對辣椒苗的促生作用最明顯。另外，乙偶姻是調(diào)節(jié)根際促生菌和植物之間相互關(guān)系的信號(hào)分子[40]。另外研究發(fā)現(xiàn)乙偶姻也能促進(jìn)擬南芥生長[41]。

4.2 在醫(yī)藥、化工行業(yè)的應(yīng)用

乙偶姻是美國能源部優(yōu)先開發(fā)的平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。如圖2所示，乙偶姻與光氣反應(yīng)生成4-氯-4, 5-二甲基-1, 3二氧雜環(huán)戊烷-2-酮(CDMDO)。

圖2 CDMDO的合成

CDMDO是一種重要的醫(yī)藥中間體，主要用于許多藥物的修飾來合成具有光學(xué)活性的手性藥物, 從而較大程度地提高藥效, 降低藥物副作用。如作為合成心血管藥物奧美沙坦，青霉素類藥物侖氨西林，氟喹諾酮類抗菌藥普盧利沙星等藥物的中間體[25]。

此外，乙偶姻的下游產(chǎn)物2, 3-丁二醇是一種重要的的化工原料和液體燃料。2, 3-丁二醇可以作為一種潛在的平臺(tái)化合物替代傳統(tǒng)的碳四烴。用于大規(guī)模的合成甲乙酮(優(yōu)良溶劑)和1，3-丁二烯(廣泛應(yīng)用于合成橡膠、聚酯和聚亞胺酯等領(lǐng)域)。2，3-丁二醇還可用于制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥、增加燃料辛烷值及藥物手性載體等。

以乙偶姻為起始原料，經(jīng)過酰氯化、成環(huán)、脫氯化氫、溴化合成4-溴甲基-5-甲基-1, 3-二氧戊環(huán)-2-酮，再和氨芐青霉素反應(yīng)合成倫氨芐西林鹽酸鹽。倫氨芐西林鹽酸鹽是半合成青霉素、氨芐青霉素的前體藥物。倫氨芐西林鹽酸鹽屬半合成青霉素類廣譜抗生素，它通過在腸壁中水解成氨芐西林而發(fā)揮抗菌作用。其抗菌作用機(jī)制與青霉素相同，主要通過與細(xì)菌主要青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合，干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而起殺菌作用。具有可口服，吸收快，穩(wěn)定性好，濃度高，比氨芐青霉素作用強(qiáng)，毒副作用低的優(yōu)點(diǎn)。對革蘭氏陽性菌如金葡菌、鏈球菌、肺炎球菌、腸球菌等和革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、奇異變形桿菌、流感桿菌等均有較好療效。 臨床上用于敏感菌所致染呼吸道感染、單純性膀胱炎、皮膚及軟組織感染，以及其他感染。

乙偶姻是一種手性化合物，手性純乙偶姻可用于合成一種新的有光學(xué)活性的α-羥基酮類衍生物，還能合成液晶材料，如手性的近晶材料和向列材料[42]。此外乙偶姻還應(yīng)用于生產(chǎn)生物柴油，生物柴油又稱脂肪酸甲酯，是一種為了應(yīng)對日益短缺的能源而研究開發(fā)出來的新型能源。生物柴油的研究越來越受到重視。生物柴油能夠轉(zhuǎn)化餐飲廢油，防止地溝油重新回到餐桌。生物柴油與傳統(tǒng)石化柴油相比具有環(huán)保，閃點(diǎn)高安全，十六烷值高從而提高發(fā)動(dòng)機(jī)壽命以及有良好的潤滑性能的優(yōu)點(diǎn)。生物柴油的制備方法有很多種，包括：酸催化法、堿催化法、脂肪酶或生物酶法和超臨界萃取法。以糖類為原料生成乙偶姻，乙偶姻再轉(zhuǎn)化為2, 3-丁二醇，2, 3-丁二醇再經(jīng)過偶聯(lián)工藝生成生物柴油。目前在很多國家生物柴油已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。

4.3 在食品、酒、煙草行業(yè)的應(yīng)用

隨著生活水平的日益提高，人們對食品的要求日益提高，越來越多的食用香料被廣泛應(yīng)用到食品行業(yè)中。目前已知的天然香料有3000多種，而合成香料則多達(dá)7000多種。其中乙偶姻作為一種具有令人愉悅的奶香味的物質(zhì)而被廣泛應(yīng)用。中國GB2760-86規(guī)定乙偶姻為允許使用的食用香料，主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型香精，也可用于奶制品中。

80%含量的乙偶姻俗稱“醋嗡”是酒類調(diào)香中一個(gè)極其重要的品種。

另外，乙偶姻在煙草行業(yè)也有廣泛應(yīng)用。乙偶姻、1-戊烯-3-醇、1-戊醇等成分具有典型的香氣特征，對煙草香氣具有良好的影響，是特香型考煙品種中特殊香氣風(fēng)格的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

4.4 在化妝品行業(yè)的應(yīng)用

乙偶姻還可以應(yīng)用在化妝品行業(yè)中，現(xiàn)如今絕大多數(shù)的香料都是通過化學(xué)合成方法得到的。但是用化學(xué)法合成的香料存在很多問題，如會(huì)給人們的健康帶來隱患，化學(xué)合成品純度下降，常含消旋混合物，提取目的異構(gòu)體或手性香料十分困難，而且人們對于合成的添加劑用于化妝品、食品越來越反感。乙偶姻被視為一種純天然的香料在化妝品行業(yè)的應(yīng)用會(huì)越來越多，具有很好的應(yīng)用前景。

近年來乙偶姻的需求量不斷地增加。目前乙偶姻的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法比如以2, 3-丁二酮為原料加氫還原合成，以2, 3-丁二醇為原料選擇性氧化合成。另外，微生物發(fā)酵法產(chǎn)生乙偶姻也是工業(yè)化生產(chǎn)乙偶姻的一種重要方法，微生物法因原料可再生，發(fā)酵條件溫和自然界中能積累高濃度乙偶姻的菌種主要包括Bacillussubtilis、Klebsiellapneumondiae、和Hanseniasporaguillieromondii。目前國外微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化。國內(nèi)的一些生物公司如愛普香料集團(tuán)股份有限公司也實(shí)現(xiàn)了乙偶姻產(chǎn)業(yè)化。生物發(fā)酵法符合可持續(xù)發(fā)展的要求，有很好的發(fā)展前景。

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