吳曉朦， 馬雪梅， 馬金彪， 姚銀安

(1．中國(guó)科學(xué)院 新疆生態(tài)與地理研究所 干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830011；2．中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

土壤鹽漬化是一個(gè)限制全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要原因，在高鹽脅迫下會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性增加、細(xì)胞內(nèi)Na+/K+離子比例失衡等，進(jìn)而對(duì)其生存造成毒害[1]。植物一般通過(guò)如下途徑抵御鹽脅迫：增加Na+外排、Na+區(qū)隔化到液泡內(nèi)和根系對(duì)Na+的限制吸收[2]。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHA負(fù)責(zé)將Na+從細(xì)胞質(zhì)排至胞外[3]。NHA基因家族在細(xì)菌中的研究較多，目前已發(fā)現(xiàn)NhaA[4]，NhaB[5]，NhaC[6]，NhaD[7-8]，NhaG[9]，NhaP[10]和NhaK[11]。在高等植物中對(duì)其研究甚少，只有NhaD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白曾在胡楊(PeNhaD1)[12]、小立碗蘚(PpNhaD1)[13]和冰葉日中花(McNhaD)[14]中被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行功能驗(yàn)證。植物中的NhaD蛋白序列與細(xì)菌中的十分相近，具有協(xié)調(diào)Na+濃度和Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)功能[15]。

位于液泡膜上的NHX基因家族通過(guò)將細(xì)胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化到液泡中、維持K+的動(dòng)態(tài)平衡[16]及調(diào)節(jié)pH值等作用保護(hù)植物不受鹽損傷，并通過(guò)囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞擴(kuò)增等方式調(diào)節(jié)植物正常生長(zhǎng)[17]。NHX基因家族分為兩個(gè)亞家族(Class I和Class II)：Class I中的成員(NHX1～4)定位在液泡膜上，負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化到液泡中，更多地研究表明AtNHX1和AtNHX3還具有轉(zhuǎn)運(yùn)K+的能力[18-19]；Class II的成員(NHX5～6)定位在液泡膜附近的高爾基體或小泡上，參與介導(dǎo)囊泡的運(yùn)輸[20]。

鹽角草(Salicorniaeuropaea)分布于中國(guó)新疆、江蘇、浙江等地，是一種典型的耐鹽植物，已經(jīng)成為研究植物耐鹽機(jī)理的模式植物[21]。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX和NhaD對(duì)于鹽生植物的正常生長(zhǎng)具有重要作用：除提高抗鹽性外，還能夠降低地上部水勢(shì)，促進(jìn)水分吸收，調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉。因此，本研究基于鹽角草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝結(jié)果，篩選出Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的RNA序列，通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析得到4條NHX全長(zhǎng)序列及1條NHA序列；為了解鹽分條件是如何調(diào)控這些基因的表達(dá)從而滿足鹽角草正常的生理功能，本研究設(shè)置了兩種鹽分轉(zhuǎn)化條件：1)鹽角草在無(wú)鹽條件下培養(yǎng)后進(jìn)行鹽分處理，確定上述基因的表達(dá)變化；2)鹽角草在200 mM 的NaCl水平下正常生長(zhǎng)，去除培養(yǎng)環(huán)境中鹽分后上述基因的表達(dá)變化。本研究可為鹽生植物Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的功能分析提供重要基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

鹽角草種子采自新疆阜康市五零零水庫(kù)周邊鹽堿地，采集后烘干備用。RNA提取試劑盒(QIAGEN 74904)購(gòu)自QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa RR037A)、熒光定量試劑(TaKaRa RR081A)購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)的電子克隆及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建對(duì)鹽角草RNA-Seq的組裝結(jié)果進(jìn)行注釋[22]，找出注釋與Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的Unigene。用電子克隆的方法獲取全長(zhǎng)cDNA序列[23]：從NCBI網(wǎng)站上下載已有的鹽角草核苷酸參考序列；用Cap3軟件對(duì)本地鹽角草序列與下載的參考序列進(jìn)行序列拼接；運(yùn)行本地Blast程序挑選出組裝結(jié)果中與本地鹽角草Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Unigene有互補(bǔ)區(qū)域的Contig；在NCBI的ORF finder網(wǎng)站上對(duì)篩選出的序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，獲得全長(zhǎng)cDNA及對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。

下載其他相近物種(如擬南芥、水稻、胡楊、玉米等)的NHX基因家族及NhaD蛋白質(zhì)序列，利用ClustalX2對(duì)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列和參考蛋白質(zhì)序列做多序列比對(duì)[24]，用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析[25]。

1.2.2 材料的處理材料處理主要包括兩類(lèi)：鹽角草在無(wú)鹽條件下培養(yǎng)后進(jìn)行鹽分處理；以及鹽角草正常生長(zhǎng)于一定濃度含鹽基質(zhì)后，進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)鹽分去除處理。對(duì)于第一類(lèi)處理，此前的研究發(fā)現(xiàn)：普通沙培基質(zhì)均含有微量或者少量鹽分，且很難消除砂培基質(zhì)中的鹽分影響，這樣導(dǎo)致鹽角草植株中往往含有相當(dāng)濃度的鹽分。因此我們分別設(shè)置砂培和瓊脂培養(yǎng)兩種條件進(jìn)行無(wú)鹽條件下的植株培養(yǎng)，從而比較兩種條件培養(yǎng)的植株在鹽分處理下的基因表達(dá)差異。張梅茹[26]、Lv[27]等研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度NaCl溶液處理下會(huì)促進(jìn)鹽角草的生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)濃度在200 mM左右；當(dāng)NaCl濃度超過(guò)最適生長(zhǎng)濃度后，抑制鹽角草生長(zhǎng)。因此本研究選取200 mM NaCl溶液作為處理試劑，在保證鹽角草正常生長(zhǎng)的前提下分析Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)}脅迫的響應(yīng)情況。

我們?cè)O(shè)置如下3種處理：

第1類(lèi)處理：鹽角草在無(wú)鹽條件下培養(yǎng)后進(jìn)行鹽分處理。

LH(低-高)處理：鹽角草種子經(jīng)4周沙培發(fā)育成幼苗(砂培的營(yíng)養(yǎng)液中不含Na+)；將幼苗從沙培環(huán)境移栽到不含鹽分的液體培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)10 d，然后更換含有200 mM的NaCl營(yíng)養(yǎng)液(培養(yǎng)液其他成分與前面相同)培養(yǎng)，培養(yǎng)8 d。從更換培養(yǎng)基前(第0天，d0)及更換后的第1、2、3、7 天每天取一份鹽角草的根和莖樣品。

LHM(低-高-MS培養(yǎng)基)處理：鹽角草種子在1/2 MS培養(yǎng)基中經(jīng)54 d發(fā)育成幼苗(培養(yǎng)基中不含Na+)；更換含有200 mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 d，從更換培養(yǎng)基前(第0天，d0)及更換后的第1、2、3、7 天每天取一份鹽角草的根和莖樣品。

第2類(lèi)處理：含鹽基質(zhì)中生長(zhǎng)的鹽角草的鹽分去除培養(yǎng)

HL(高-低)處理：鹽角草種子經(jīng)4周沙培發(fā)育成幼苗(砂培的營(yíng)養(yǎng)液中不含Na+)；將幼苗從沙培環(huán)境移栽到含有200 mM的液體培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)10 d；然后更換不含Na+的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)8 d。從更換培養(yǎng)基前(第0 d，d0)及更換后的第1、2、3、7天每天取一份鹽角草的根和莖樣品。

所有樣品采集后立即用液氮速凍防止mRNA降解，在-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。樣品用于熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)上述5個(gè)基因的表達(dá)量變化情況。

1.2.3鹽角草總RNA的提取和cDNA的合成用QIAGEN公司RNA提取試劑盒分別提取不同處理方法、不同組織的鹽角草樣品總RNA；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)，確保RNA質(zhì)量合格，并記錄RNA濃度。

按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，不同樣品以相同的RNA上樣量反轉(zhuǎn)錄成cDNA，濃度稀釋10倍備用。

熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)：以alphatubulin基因作為內(nèi)參基因，按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，用Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)PCR引物序列。alpha tubulin基因上游引物為5′-AGGTCAACAAAGACAGCA-3′，下游引物為5′-AGCGAAAATGAGAGAGTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為215 bp。

根據(jù)鹽角草RNA-Seq組裝注釋結(jié)果，合成鹽角草Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 鹽角草Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primer pairs and products’ length of Salicornia Na+/H+ antiporters

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR PremixExTaqTM(2×) 10 μL，超純水6.4 μL，上下游引物(10 nmol/l)各0.8 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：由65℃增溫至95℃，每5 s增加0.5℃。每個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值。qPCR值提高1倍或者降低50%以上，認(rèn)為其表達(dá)量發(fā)生變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 從RNA-Seq結(jié)果中篩選Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

從NCBI網(wǎng)站上搜索到已有鹽角草核苷酸序列654條、EST序列1439條，經(jīng)電子克隆分析后，獲得5條完整的鹽角草Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)應(yīng)cDNA序列，將其命名為SeNHX1、SeNHX3、SeNHX4、SeNHX5和SeNhaD。構(gòu)建的N-J進(jìn)化樹(shù)如圖1所示。

由圖1可知NHX基因家族分為3部分，NHX1～NHX4(Class I)、NHX5～NHX6(Class II)和SOS。SeNHX1、SeNHX3和SeNHX4分布在Class I中，SeNHX5分布在Class II中，SeNhaD與植物的NhaD蛋白序列能夠較好地聚類(lèi)。

圖1 鹽角草與其他植物Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig 1 Phylogenetic analysis of Na+/H+ antiporters of Salicornia europaea and other plants

At:Arabidopsisthaliana[28], Le:Solanumlycopersicum[29], Mc:Mesembryanthemumcrystallinum[14], Ol:Ostreococcuslucimarinus[30], Os:Oryzasativa[31], Pe:Populuseuphratica[12, 32], Pp:Physcomitrellapatenssubsp.patens[13], Se:Salicorniaeuropaea, Ta:Triticumaestivum[33], Zm:Zeamay[34]

2.2 熒光定量PCR結(jié)果

一次熒光定量PCR中檢測(cè)LH/LHM或HL處理下所有樣品的某個(gè)基因表達(dá)量，以alphatubulin作為內(nèi)參基因。故每次反應(yīng)會(huì)有兩種擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。從圖2-B和2-C中可以看出 ，只有內(nèi)參基因和檢測(cè)基因的目的片段被擴(kuò)增，沒(méi)有非特異擴(kuò)增或引物二聚體的生成。

圖2熒光定量反應(yīng)擴(kuò)增信號(hào)及溶解曲線(A—擴(kuò)增曲線; B、C—溶解曲線)
Fig 2 Detection plot and Dissociation curve of RT-PCR

2.2.1 LH地下部各基因表達(dá)量變化因?yàn)長(zhǎng)HM處理的植物地下部無(wú)法采樣，故只有LH地下部的分析結(jié)果，見(jiàn)圖3。在升高鹽濃度處理后的幾天，根系中SeNHX3(圖3B)和SeNHX5(圖3D)的應(yīng)激反應(yīng)明顯，其表達(dá)量呈震蕩狀，均在第1、3天顯著提高。SeNHX1、SeNHX4和SeNhaD表達(dá)趨勢(shì)都是在處理后第2、第3天大幅度提高，隨后降低。

圖3 LH處理樣品地下部中Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量的變化Fig 3 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in LH root sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD; d0—the treatment day; d1—the day after treatment; and so on

2.2.2 LH、LHM地上部各基因表達(dá)量變化LH和LHM處理下樣品地上部各基因相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。LHM處理下SeNHX1(圖4A)和SeNHX5(圖4D)在第3 d表達(dá)量顯著增高，隨后回落至之前的表達(dá)水平；而LH處理下這兩個(gè)基因分別在第3 d和第2 d表達(dá)量顯著加強(qiáng)后回落。SeNHX3(圖4B)基因在LH處理下處理1 d即大幅度提高，隨后降低，而LHM處理2 d后表達(dá)量顯著下降。SeNHX4(圖4C)在LH處理下表達(dá)量高于LHM處理，鹽分處理1 d后均顯著升高，隨后降低。SeNhaD(圖4E)在LH處理后的第2天有大幅增高，但在LHM處理中沒(méi)有受到影響。

SeNHX1、SeNHX3和SeNHX5在兩種處理下表達(dá)基數(shù)都比較高，總的來(lái)看LHM處理的表達(dá)變化比LH更明顯。

圖4 LH處理樣品地上部中Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量的變化Fig 4 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in LH shoot sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD

圖5 HL處理樣品地下部中Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量的變化Fig 5 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in HL root sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD

2.2.3 HL地下部各基因表達(dá)量變化由圖5中可以看出在HL地下部中，SeNHX1(圖5A)、SeNHX3(圖5B)、SeNHX5(圖5D)具有相同的表達(dá)趨勢(shì)，在處理后第1 d表達(dá)量大幅度降低并隨后基本保持穩(wěn)定。而NhaD(圖5E)在處理第1天下降后又提高了其表達(dá)量。SeNHX4(圖5C)在處理前幾乎不表達(dá)，處理后的前3天其表達(dá)量升高后回落至低表達(dá)狀態(tài)。

2.2.4 HL地上部各基因表達(dá)量變化各基因相對(duì)于alphatubulin的表達(dá)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6。SeNHX1(圖6A)的表達(dá)水平在剛降低鹽濃度處理后的第1天，其表達(dá)量有明顯的增高變化，隨后降低至處理當(dāng)天的水平并基本保持穩(wěn)定。而SeNHX5(圖6D)在鹽分去除后2 d表達(dá)量顯著降低。相反，SeNHX3(圖6B)在處理后表達(dá)量在第7天顯著上升；而SeNHX4(圖6C)的表達(dá)基數(shù)較低，僅在第2天顯著降低后很快恢復(fù)。SeNhaD(圖6E)在處理后3 d降低了表達(dá)量，隨后提高。通過(guò)Barrero-Gil J等人的表達(dá)定位實(shí)驗(yàn)[13]表明，在小立碗蘚中PpNhaD逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于葉綠體中。葉綠體位于地上部的葉片中，培養(yǎng)基中鹽濃度的變化要經(jīng)過(guò)維管束向上傳遞，所以SeNhaD表達(dá)量在地上部中比2.2.3中地下部要變化遲緩。

圖6 HL處理樣品地上部中Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量的變化Fig 6 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in HL shoot sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD

3 討論

參與細(xì)胞內(nèi)離子平衡調(diào)節(jié)的基因有NHA和NHX基因家族：NHA負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+排出胞外，以降低細(xì)胞內(nèi)的滲透壓；NHX基因家族可將細(xì)胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化到液泡中，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)定和Na+、K+平衡起到十分重要的作用[35-36]。

對(duì)于鹽角草NHX基因家族和NhaD基因的表達(dá)量我們可以看到，在植株的根、莖中只在處理后很少的時(shí)間點(diǎn)中升高或者降低，并很快恢復(fù)到處理前常態(tài)水平。此前的研究也表明植物響應(yīng)鹽分調(diào)控僅在處理的前幾天發(fā)生變化然后恢復(fù)常態(tài)，而差異蛋白質(zhì)在鹽分處理初期和中后期均有較大的變化[37]。說(shuō)明提高或者降低基因表達(dá)使功能蛋白升高或者降低到一定程度后，基因表達(dá)就會(huì)恢復(fù)到處理前狀態(tài)，從而保持了其精確調(diào)控的特性。

NHX1和NHX2的功能是將Na+區(qū)隔到液泡中，影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，這兩個(gè)蛋白還對(duì)控制植物細(xì)胞的擴(kuò)增、雄性生殖器官的生長(zhǎng)和開(kāi)花都是不可缺少的[28]。本實(shí)驗(yàn)中SeNHX1在鹽角草地上部和地下部中都有較高水平的表達(dá)，當(dāng)升高鹽濃度處理時(shí)其根莖的表達(dá)量均在2～3 d鹽分處理后達(dá)到表達(dá)量最高點(diǎn)。類(lèi)似的，在Anupama等人的研究結(jié)果中也報(bào)道過(guò)海蓬子(Salicorniabrachiate)中SbNHX1在鹽處理后48 h其表達(dá)量最高[39]；而在去除鹽分處理中，我們發(fā)現(xiàn)SeNHX1根系表達(dá)量也大幅度下調(diào)；表明該基因的表達(dá)受到鹽分濃度的影響。此外，SeNHX1地上部表達(dá)量在去除鹽分處理后的第1天有大幅度提高，可能是因?yàn)榈厣喜扛惺艿轿⒐苁}離子含量的降低，為維持其正常生長(zhǎng)，提高NHX1基因表達(dá)有助于吸收和爭(zhēng)奪維管束鹽分。

NHX3和NHX4參與液泡中Na+的吸收，并且NHX3與K+轉(zhuǎn)運(yùn)有密切關(guān)系[19]，Cosentino等[14, 28]和Liu等[19]的結(jié)果表明NHX3在地上部和地下部中表達(dá)量都很低；然而在鹽生植物中NHX3可能發(fā)揮著重要作用，鹽生植物液泡要主動(dòng)吸收并維持較高的鹽分含量以降低胞內(nèi)水勢(shì)從而維持水分吸收功能。因此我們看到鹽角草中SeNHX3的表達(dá)量較高，其表達(dá)水平和對(duì)鹽分的響應(yīng)特點(diǎn)也與SeNHX1接近；NHX4的表達(dá)情況與其他物種相同，表達(dá)量很低，在地下部中幾乎檢測(cè)不到。

與液泡內(nèi)表達(dá)的NHX家族成員1～4不同，Bassil等人[40]發(fā)現(xiàn)NHX5和NHX6定位于細(xì)胞內(nèi)的高爾基體和反面高爾基體分子標(biāo)志(trans-Golgi network markers)上。通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)NHX5和NHX6介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸[40]，并對(duì)維持植物細(xì)胞內(nèi)pH值穩(wěn)定、離子平衡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SeNHX5的表達(dá)量與基質(zhì)中鹽分含量相關(guān)：增高鹽濃度時(shí)，其表達(dá)增加；去除基質(zhì)鹽分其表達(dá)降低。表明SeNHX5的表達(dá)量與鹽角草鹽脅迫有相關(guān)性。

NHA在星星草(P.tenuiflora)的地下部受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)顯著，而在水稻中則主要在地上部經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)[3]，冰葉日中花的McNhaD基因在地上部的表達(dá)量遠(yuǎn)大于其在地下部的表達(dá)[14]。在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，NhaD在地上部的表達(dá)量是地下部的2倍左右，這個(gè)結(jié)果與水稻和冰葉日中花的趨勢(shì)相同。并且NhaD在地上部的表達(dá)變化時(shí)間點(diǎn)較地下部中遲1～2 d。在小立碗蘚中的研究表明，NhaD表達(dá)定位于地上部的葉綠體中[13]。鹽角草中地上部細(xì)胞外鹽濃度變化小于根部，使NhaD在地上部表達(dá)量變化時(shí)間晚于根部。

整體來(lái)看，在上述結(jié)果中NHX1、NHX3、NHX5的表達(dá)量明顯高于NHX4和NhaD。當(dāng)鹽處理時(shí)，這5個(gè)基因在地下部中表達(dá)差異更明顯。此前在耐鹽樹(shù)種胡楊中發(fā)現(xiàn)NHX1、NHX3和NHX6的表達(dá)要遠(yuǎn)高于普通楊樹(shù)種[32]，我們推測(cè)NHX1、NHX3和NHX5對(duì)于鹽角草的耐鹽機(jī)制也起到很大的作用。

前人一般將鹽分處理實(shí)驗(yàn)(LH)的植株培養(yǎng)于沙培基質(zhì)，由于很難清除沙石本身含有Na+，導(dǎo)致鹽分處理前植株體內(nèi)就含有Na+，這可能對(duì)鹽生植物鹽分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的分析產(chǎn)生較大的系統(tǒng)誤差；本研究對(duì)沙培和瓊脂培養(yǎng)(LHM)植株分別進(jìn)行了鹽分處理，以比較Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)鹽分的不同響應(yīng)。后者植株生長(zhǎng)于瓊脂培養(yǎng)基，植株在處理前完全不含Na+。我們的研究表明植株含有Na+和不含Na+情況下，鹽處理對(duì)上述5個(gè)基因的表達(dá)有較大的差別，多數(shù)NHX基因在LHM處理中變化更大，這可能與其感受到更為劇烈的鹽分變化有關(guān)。而NhaD基因LHM處理下基本不變，原因有待進(jìn)一步研究。

綜上，我們的研究結(jié)果表明，NHX基因家族和NhaD的表達(dá)量受到基質(zhì)中鹽分含量的調(diào)控作用，其表達(dá)在鹽分處理或者鹽分去除1～3 d后發(fā)生變化?；虮磉_(dá)受控于植物的精確調(diào)節(jié)，其基因功能還受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯、翻譯后調(diào)控等影響，因此基于NHX蛋白質(zhì)表達(dá)的研究有助于進(jìn)一步說(shuō)明鹽生植物NHX基因?qū)}分的響應(yīng)特點(diǎn)。

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