王瑋蔚， 王冬梅， 沈 佳， 孫 雪

(1. 寧波大學 海洋學院， 浙江 寧波315211; 2. 浙江省海洋生物工程重點實驗室， 浙江 寧波315211)

真核藻類中對CA研究最廣泛的是萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻中存在12種編碼CA的基因，包括3條α-CA，多分布于周質(zhì)空間，6條β-CA，分布于線粒體、細胞質(zhì)、葉綠體中，3條γ-CA，全為線粒體CA[7]；在綠藻Ostreococcuslucimarinus中也發(fā)現(xiàn)1條β-CA及1條類似硅藻中δ-CA的CA基因[8-9]；從三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中鑒定出12條CA基因，包括5條α-CA、3條β-CA和4條γ-CA[10-11]；在假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)中分離到13條CA基因，包括3條α-CA、5條γ-CA、4條δ-CA及1條ζ-CA[12]。

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是綠藻門的一種重要經(jīng)濟微藻，具有較高的光合效率。小球藻中碳酸酐酶的研究大多集中在CA活性與環(huán)境因素的關系、CA酶的鑒定等方面[13-14]，而關于CA基因的研究比較少，只有同屬小球藻C.sorokiniana中一條 α-CA全基因序列的報道[15]。隨著小球藻C.variabilisNC64A全基因組序列的闡明[16]，揭示了該小球藻中3種(α-、β-、γ-CA)共10條CA。由于CA序列保守性很差，很難通過同源性比對設計簡并引物的方法獲得未知CA基因序列，因此只能通過基因組或轉(zhuǎn)錄組測序來獲得某一物種的全部CA基因序列。

本文在前期工作中對海水蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)820進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了一批CA基因。本文選取其中部分序列通過生物信息學軟件分析了其中3種類型CA編碼蛋白的理化性質(zhì)、亞細胞定位和高級結構等，希望為小球藻CA的分類、定位、作用機制及后續(xù)的實驗研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 CA序列的獲取

蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)820，來自寧波大學海洋生物工程重點實驗室藻種室。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強度為40 μmol/m2·s，光暗周期為12L∶12D。

將處于對數(shù)生長中期的蛋白核小球藻820使用Trizol試劑進行總RNA提取，然后送深圳華大基因科技有限公司(BGI)進行轉(zhuǎn)錄組測序。所有的測序序列存儲在Short Read Archive (SRA) database中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra，登錄序列號為SRX399080)。分別利用NR、NT、SwissProt、KEGG、COG 和GO數(shù)據(jù)庫進行基因的功能注釋，查找全部CA基因。從CA基因中分別選取代表α-、β-、γ-亞型的各一種CA進行分析，它們的基因編號分別為Unigene13488、Unigene11800和Unigene8070。

1.2 分析方法

1.2.1 CA編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

在NCBI上通過ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，查找其可能的開放閱讀框。分別對蛋白核小球藻3種類型的CA基因進行分析，利用ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/pi-tool.html)對推測的CA編碼蛋白進行基本理化性質(zhì)分析，包括等電點(pI)、相對分子質(zhì)量(Mw)、脂肪族系數(shù)、平均疏水性及穩(wěn)定性等。

1.2.2 CA基因編碼蛋白亞細胞定位預測

通過PSORT Prediction(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html)對CA基因編碼的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位預測。

1.2.3 CA基因編碼蛋白跨膜區(qū)域分析

利用Tmpred (http://www.ch.embenet.org/cgi-bin/TMPRED-form.html) 對3條基因所編碼的蛋白質(zhì)跨膜結構域進行分析。

1.2.4 CA基因編碼蛋白信號肽分析

用Signal4.0 Server在線軟件對3條CA基因所編碼的蛋白質(zhì)進行信號肽分析。

1.2.5 CA基因編碼蛋白二級結構及三級結構預測

通過NNPredic(http://www.cmpharm.ucsf.edu/～nomi/nnpredict.html)和SWISS-MODEL在線軟件，預測3條CA基因編碼蛋白質(zhì)的二級結構及三級結構。

2 結果與分析

2.1 CA編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

表1 蛋白核小球藻CA的理化性質(zhì)分析

蛋白核小球藻3條CA理化性質(zhì)分析結果如表1所示， 3條CA序列編碼蛋白的等電點分別為4.6、6.31和6.44，均為酸性蛋白，其中α-CA、γ-CA為穩(wěn)定性蛋白，β-CA為不穩(wěn)定性蛋白，三者的分子量分別為28.9 kDa、34.9 kDa和24.8 kDa；平均疏水值(GRAVY)的范圍在2與-2之間，α-CA、β-CA和γ-CA的GRAVY值分別為-0.000、-0.369和-0.061，顯示為微親水蛋白，其親水性的強弱依次為β-CA>γ-CA>α-CA。脂肪族系數(shù)指蛋白質(zhì)脂肪側鏈占蛋白質(zhì)的相對含量，由蛋白質(zhì)中Ala、Val、Ile和Leu的含量所決定?？梢钥闯?，α-CA、β-CA、γ-CA所編碼的蛋白脂肪側鏈的含量高達80%～90%，推測其均為脂溶性蛋白。

2.2 CA基因編碼蛋白亞細胞定位預測

對α-CA、β-CA及γ-CA基因編碼的蛋白進行亞細胞定位分析后得到如下結果，α-CA蛋白定位于周質(zhì)空間、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、過氧化物酶的可信度分別為0.79、0.3、0.2和0.141；β-CA蛋白定位于細胞質(zhì)、葉綠體基質(zhì)、線粒體基質(zhì)空間的可信度分別為0.45、0.4和0.1；γ-CA編碼蛋白定位于細胞質(zhì)、微體(過氧化物酶體)、線粒體基質(zhì)空間、葉綠體類囊體膜的可信度分別為0.45、0.388、0.36和0.1。上述分析表明，α-CA可能為胞外CA，β-CA為胞內(nèi)CA且很可能位于細胞質(zhì)或葉綠體基質(zhì)中，γ-CA為胞內(nèi)CA，分布于細胞質(zhì)、微體及線粒體中的可能性較大。

2.3 CA基因編碼蛋白跨膜區(qū)域分析

跨膜結構域一般由20個左右的疏水氨基酸組成，包括α-螺旋和β-折疊，其疏水鍵通過范德華力與磷脂雙分子層相互作用，是膜內(nèi)蛋白與膜脂結合的重要部位[17]?？缒そY構域的分析結果結合亞細胞定位的預測，有利于推測其在細胞內(nèi)具體位置及功能作用。

3條CA跨膜結構域預測結果見圖1，α-CA基因編碼的蛋白由外向內(nèi)，即N末端裸露在外的只有一個可能的強跨膜區(qū)域，位于23～42氨基酸之間，預測分值為1594；β-CA跨膜結構域預測分值小于500，無可信的跨膜結構；γ-CA最可能有的跨膜區(qū)域為162～180氨基酸處，但預測分值較低，為549，可信度很低。上述結果印證了α-CA、β-CA和γ-CA基因編碼的蛋白分別為胞外CA、胞內(nèi)CA和胞內(nèi)CA的推測。

圖1蛋白核小球藻3種CA的跨膜結構域預測

Fig 1 Transmembrane domain prediction of amino acid sequence deduced from α-CA, β-CA and γ-CA genes inChlorellapyrenoidosa

圖2 蛋白核小球藻3種CA編碼蛋白的信號肽預測

2.4 CA基因編碼蛋白信號肽分析

用Signal4.0 Server在線軟件分析表明，α-CA編碼的蛋白序列存在信號肽，且信號肽區(qū)域為14～46氨基酸區(qū)間，β-CA、γ-CA編碼的蛋白序列不存在信號肽，結合其定位分析，可以推測α-CA蛋白屬于胞外周質(zhì)空間酶或胞內(nèi)單層細胞器內(nèi)酶，β-CA、γ-CA屬于胞內(nèi)細胞質(zhì)酶。

2.5 CA基因編碼蛋白二級結構及三級結構預測

大量的無規(guī)則卷曲可以使蛋白結構擁有足夠的空間，受側鏈相互作用的影響很大，是構成蛋白質(zhì)特異功能部位和酶活性部位的主要二級結構形式，如許多鈣結合蛋白中結合鈣離子的E-F手形結構中央環(huán)。從表2可以看出，α-CA中無規(guī)則卷曲所占比例最高(64.66%)，而β-CA和γ-CA中無規(guī)則卷曲與α-螺旋所占比例相近，分別為44.13%和44.76%、40.34%和39.48%，這可能與其在細胞內(nèi)的功能、定位有關。

表2 蛋白核小球藻3種CA二級結構預測

蛋白質(zhì)的三級結構指球狀蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級結構的基礎上相互配置而形成特定的構象。α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結構通過側鏈基團的相互作用進一步卷曲、折疊，借助次級鍵的維系形成三級結構，三級結構的形成使肽鏈中所有的原子都達到空間上的重新排布，它是建立在二級結構、超二級結構和結構域基礎上的球狀蛋白質(zhì)的高級空間結構。通過SWISS-MODEL在線軟件對α-CA、β-CA和γ-CA蛋白質(zhì)三維結構進行預測結果如圖3所示。圖中所示β-CA、γ-CA蛋白的三級結構明顯不同于α-CA，α-CA折疊程度較輕且結構松散，β-CA、γ-CA折疊程度較復雜緊密，并且γ-CA三級結構出現(xiàn)重復折疊的結構。這種三級結構與其二級結構組成有很大關系，同時這些高級結構也有利于其功能的發(fā)揮。

圖3 蛋白核小球藻3種CA的三維結構預測

3 討論

隨著基因組和功能基因組研究的廣泛開展，生物信息學理論和方法得到了迅猛發(fā)展和廣泛的應用。由于CA基因序列獲得多是通過大規(guī)模測序得到，僅依靠相近物種基因序列的保守性來設計簡并引物很困難，因此獲得CA基因完整序列并進行生物信息學分析的物種并不多。如海帶配子體中一條α-CA基因的生物信息學分析結果表明其分子量為32.53 kDa，等電點為5.12，是酸性、疏水、穩(wěn)定型蛋白，位于葉綠體中[18]。該α-CA與本文中所分析的α-CA在分子量、等電點、穩(wěn)定性和細胞定位方面均不同。

高等植物與藻類細胞CA主要包括細胞質(zhì)CA、葉綠體CA和線粒體CA 3種類型[19-21]。CA位于細胞的不同部位可能與其所承擔的功能相關。對萊茵衣藻中α-CA、β-CA和γ-CA細胞定位研究分析顯示，2條α-CA為周質(zhì)CA，1條α-CA位于類囊體腔；6條β-CA分別位于線粒體、葉綠體基質(zhì)、細胞質(zhì)及周質(zhì)中；而3條γ-CA均位于線粒體[7]。對本文的α-CA分析發(fā)現(xiàn)其具有一個信號肽區(qū)域和一個強的跨膜結構，且二級結構及三級結構較β-CA、γ-CA松散，結合其亞細胞定位，我們推測它為胞外CA且位于細胞質(zhì)膜與細胞壁之間。β-CA無可信的跨膜結構，無信號肽區(qū)域，亞細胞定位結果顯示其可能位于細胞質(zhì)和葉綠體基質(zhì)中。γ-CA有一可信度很低的跨膜結構(162～180個氨基酸)，無信號肽區(qū)域，亞細胞定位結果顯示其位于細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體基質(zhì)的可能性相似，再結合γ-CA幾乎都位于線粒體中以及萊茵衣藻中所有γ-CA也都位于線粒體中的結果[7,22]，我們將本文的γ-CA定位于線粒體基質(zhì)中。

基因編碼蛋白質(zhì)二級結構及三級結構的預測并結合其亞細胞定位、信號肽、跨膜結構域的分析有利于研究、推測其生物學功能，二級結構在一定程度上能決定三級結構，三級結構決定蛋白質(zhì)的功能和其在細胞中的定位。α-CA、β-CA及γ-CA的二級及三級結構有很大程度的不同，這可能與其各自在細胞中所發(fā)揮的功能有關，但確切的亞細胞定位和功能還需要通過免疫熒光、膠體金細胞定位等方法及CA酶活性測定和表達水平等研究后進一步確定。

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