宋丹丹， 楊銳, 2， 任繼銳， 莫雅婷， 文欣

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室, 浙江 寧波 315211； 2. 寧波大學(xué) 海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗室, 浙江 寧波 315211)

顆石藻是一類海生或咸水生光自養(yǎng)型單細(xì)胞鞭藻類，屬于金藻門(Chrysophyta)，顆石藻綱(Coccolithophyceae)[1]，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中基本的初級生產(chǎn)力，也是深海碳酸鹽和海洋油氣層最重要的碳?xì)湮镔|(zhì)來源[2]。顆石藻生活在相對高硝酸鹽、低磷酸鹽、高光和低微型浮游動物的水體中，幾乎分布在世界范圍的近海和大洋水域中[3]，可固定碳量2×1010～2×1011t，換算成CO2為7333×108t[4]，在海洋地球碳循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。顆石藻可以通過鈣化作用在細(xì)胞外形成由碳酸鈣 (CaCO3)構(gòu)成的鱗片狀顆粒外殼[5-6]，這些顆粒被稱為顆石粒 (coccolith)，成為研究生物礦化機(jī)理的重要材料[7]。顆石藻由于對生存環(huán)境的酸堿性有很強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力，在適宜的堿性條件下，一天內(nèi)就可以重新恢復(fù)活躍的種群生活狀態(tài)并短期內(nèi)迅速增殖，因此顆石藻也是大洋和高緯度海洋發(fā)生水華的常見類群[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

材料：顆石藻(P.carterae)分離自浙江省象山港海水蝦塘致害水華，由寧波大學(xué)藻種室保存。紫菜附生假交替單孢菌(Pseudoalteromonassp. NPYS3)分離自南通條斑紫菜。

主要藥品：酵母粉，蛋白胨，檸檬酸鐵，KNO3，K2HPO4，MnSO4，CaCl2，MgCl2，NaHCO3，H3BO4，NaCl，Na2SiO3，KCl，Na2-EDTA，Na2SO4，NaNO3，NaH2PO4，F(xiàn)eCl3·6H2O，CuSO4·5H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2·6H2O，MnCl·4H2O，Na2MoO4·2H2O，維生素B1，維生素B12，生物素，均購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗中培養(yǎng)液均采用添加了NMB3#的人工海水[13]。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理

顆石藻純化：取少量藻接種于充分滅菌的培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，平板劃線，獲得單藻落，抗生素處理，培養(yǎng)至密度為1.8×105個/mL備用。

假交替單孢菌的活化及菌懸液的制備：取少量菌種經(jīng)細(xì)菌液體Zobel 2216E培養(yǎng)基[14]活化3次，收集充分活化后的假交替單孢菌，離心(10 000 r/min，5 min)后用無菌生理鹽水制備菌懸液，血球計數(shù)板計數(shù)[15]，調(diào)整其密度為5.4×108cfu/mL ，置于4℃冰箱備用。

1.2.2 假交替單孢菌培養(yǎng)

取1 mL密度為 5.4×108cfu/mL的菌懸液接種于裝有280 mL不同初始pH值(6.5、7.5和8.5)的無菌NMB3#培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每組3個平行，于37℃搖床中培養(yǎng)。定時取樣測定其pH值變化。

1.2.3 顆石藻培養(yǎng)

取70 mL備用藻液加入裝有280 mL不同初始pH值(6.5、7.5和8.5)的無菌NMB3#培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，每組3個平行，置于恒溫光照培養(yǎng)箱(GXZ型，寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25℃，40 μE/m2·s，L∶D=12∶12。每天定時搖藻2次，每4 h檢測培養(yǎng)體系的pH值，每12 h檢測藻的生長狀況。

1.2.4 顆石藻與假交替單孢菌共培養(yǎng)

取70 mL備用藻液和1 mL備用菌懸液一起接種于含280 mL不同初始pH值(6.5、7.5和8.5)的無菌NMB3#培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.3。前48 h每4 h取樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、測pH值，48 h后每12 h進(jìn)行上述指標(biāo)的測定。于0 h、16 h和156 h利用熒光法檢測顆石藻鈣化情況。

1.2.5 檢測方法

1)細(xì)胞計數(shù)。取1 mL的藻液于EP管中，加1滴5%的甲醛溶液固定藻樣，靜置20 min后，利用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，方法參考[14]。2)pH值的測定。取2 mL培養(yǎng)液于EP管中，用梅特勒SevenEasy pH計-FE20測定培養(yǎng)液pH值。3)熒光法測定鈣化情況[16]。取2 mL藻液于EP管中，離心(4000 r/min，5 min)，棄上清，加入2 mL缺鈣人工海水多次清洗離心，棄上清；加入0.5 mol/L的MES溶液(9.762 g MES加去離子水定容到100 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值5.5)1 mL，靜置2 h。分別取200 μL上清液和10 μL稀釋后的熒光指示劑(按1∶10的比例稀釋)加入到Tissue Culture Testplate熒光板中， 25℃靜置20 min。用Thermo(AORION)儀測量其熒光值，激發(fā)波長488 nm，吸收波長526 nm。計算顆石藻鈣化狀況。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way Anova和Two-way Anova分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同起始pH值下純培養(yǎng)和藻菌共培養(yǎng)時顆石藻種群生長情況

2.1.1 純培養(yǎng)時顆石藻的生長密度變化

在前12 h內(nèi)，3個pH值下的種群密度均未出現(xiàn)明顯增加， 12～108 h顆石藻呈快速增長，進(jìn)入對數(shù)生長期；108 h之后細(xì)胞生長達(dá)到穩(wěn)定期。起始pH值7.5體系中顆石藻在前96 h增殖速率較其它兩組快；而起始pH值6.5的體系中種群密度相對其它兩組增殖的較慢。達(dá)到穩(wěn)定期后，起始pH值8.5、7.5和6.5的體系中，顆石藻的密度依次降低(圖1)。

圖1 不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)條件下156 h內(nèi)顆石藻種群的生長

One-way Anova分析結(jié)果(表1)顯示：P<0.01，即不同pH值對顆石藻生長的影響極顯著。

表1 顆石藻在不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)下生長密度的方差分析

2.1.2 NPyS3-顆石藻共培養(yǎng)時顆石藻生長密度的變化

NPyS3-顆石藻共培養(yǎng)時，顆石藻在不同起始pH值(6.5、7.5和8.5)下的生長規(guī)律(圖2)與其單獨(dú)培養(yǎng)的趨勢相似，起始pH值8.5的體系中顆石藻生長相對最好，而pH值6.5的菌藻共培養(yǎng)體系中，顆石藻的生長明顯比pH值7.5和8.5共培養(yǎng)體系的緩慢；但3種pH值條件下顆石藻的細(xì)胞密度均顯著降低(P<0.01)，分別僅為純培養(yǎng)的63.7%，61.0%和56.1%。菌藻共同培養(yǎng)體系下，顆石藻前36 h生長趨勢緩慢上升，36 h后呈快速增長，進(jìn)入對數(shù)生長期的時間比純培養(yǎng)推遲了24 h。

圖2 不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)條件下菌藻共同培養(yǎng)體系中156 h內(nèi)顆石藻種群的生長

Two-way Anova分析結(jié)果(表2)顯示，菌：P<0.01，即在菌藻共同培養(yǎng)體系中假交替單孢菌對顆石藻生長的影響是極顯著的；pH：P>0.05，即在菌藻共同培養(yǎng)體系中pH對顆石藻生長無顯著影響。該數(shù)據(jù)表明：在菌藻共培養(yǎng)體系中NPyS3對顆石藻生長的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于低pH對它的影響。

表2 不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)和菌對顆石藻生長影響的Two-way Anova分析

2.2 不同起始pH值下各培養(yǎng)體系中pH值變化情況

Psuedoalteromonassp. NPyS3、顆石藻、菌藻共培養(yǎng)體系的pH值變化規(guī)律見圖3。NPyS3可以向堿性方向調(diào)整體系的pH值，培養(yǎng)體系的pH值最終穩(wěn)定在8.5左右。顆石藻在不同起始pH值的體系中單獨(dú)培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)體系pH值呈晝夜節(jié)律變化，且隨著培養(yǎng)時間的延長，pH值周期性振蕩幅度增大。與純培養(yǎng)相比，菌藻共培養(yǎng)體系出現(xiàn)晝夜節(jié)律的時間推遲到48 h，這一差異與培養(yǎng)體系進(jìn)入對數(shù)生長期的時間延遲相一致；而且在156 h內(nèi)，菌藻共培養(yǎng)體系的pH值持續(xù)上升，高達(dá)10.23；不同培養(yǎng)體系的pH差異極顯著(P<0.01)。

圖3不同起始pH值條件下培養(yǎng)體系pH變化(A—NPyS3純培養(yǎng)；B—顆石藻純培養(yǎng)；C—NPyS3-顆石藻共培養(yǎng))

Fig 3 The changes of pH value of the cultured medium at different initial pH (6.5, 7.5 and 8.5) values

圖4 不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)條件下，顆石藻細(xì)胞在0 h、16 h、156 h時的鈣化情況(A—顆石藻純培養(yǎng)；B—NPyS3-顆石藻共培養(yǎng))

2.3 不同起始pH值條件下純培養(yǎng)和藻菌共培養(yǎng)時顆石藻鈣化情況

顆石藻純培養(yǎng)和NPyS3-顆石藻共培養(yǎng)體系在0 h時，顆石藻鈣化程度相似。16 h時，顆石藻純培養(yǎng)體系中，起始pH為值7.5和8.5的鈣化程度相似，而起始pH值為6.5的鈣化程度明顯低于前兩者；NPyS3-顆石藻共培養(yǎng)體系中，顆石藻鈣化程度顯著低于純培養(yǎng)(P<0.01), 從pH值8.5、7.5到6.5依次降低。第156 h時，不論純培養(yǎng)還是共培養(yǎng)體系，pH值8.5體系的顆石藻細(xì)胞鈣化程度均為最高，pH值6.5體系的最低(圖4)；而與純培養(yǎng)相比，菌藻共培養(yǎng)體系中顆石藻的鈣化程度受到顯著抑制。

One-way Anova分析不同起始pH值下培養(yǎng)的顆石藻種群鈣化情況(表3)：0.01

表3 不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)對顆石藻鈣化影響的方差分析

不同起始pH值下菌藻共同培養(yǎng)體系中顆石藻種群鈣化情況的Two-way Anova分析結(jié)果(表4)顯示，菌：0.010.05，即在菌藻共同培養(yǎng)體系中，不同起始pH值對顆石藻鈣化的影響不顯著。

表4 不同起始pH值(6.5、7.5、8.5)和菌對顆石藻鈣化影響的方差分析

3 討論

顆石藻是一種適宜在堿性條件下生活的藻類，其最適pH值9.0左右[5-6]。它的增殖與水域的光照、溫度有確定的正相關(guān)系，而與氮、磷等營養(yǎng)鹽的關(guān)系則存在差異，偏低營養(yǎng)和偏高營養(yǎng)的水域中都有易于增殖的種類[12]。表層海水pH值的微小變化就會阻礙某些藻類生物形成碳酸鈣的能力，足以使這些生物難以生長[10]。本實(shí)驗中，顆石藻在酸性環(huán)境下可以長時間存活且進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，但是生長增殖受到顯著抑制(P<0.01)。在渡過酸性適應(yīng)期后，顆石藻呈現(xiàn)長時間連續(xù)增殖，這可能與該藻在營養(yǎng)條件、環(huán)境因子優(yōu)化后，短期內(nèi)可以恢復(fù)活躍的種群生活狀態(tài)并迅速增殖的特征吻合[7, 10]。

已有研究表明，大氣中CO2濃度升高影響了海洋中生物的鈣化過程[17]。藻類鈣化作用依賴于細(xì)胞的生理活動，也依賴于海洋環(huán)境的穩(wěn)定性[18]。海洋酸化會直接或間接地影響鈣化藻類的生長和鈣化，威脅鈣化種群的生存[9-10, 19]。本研究顯示：低pH值顯著抑制顆石藻的鈣化作用，無論有無細(xì)菌的參與，堿性條件下顆石藻的鈣化程度均比酸性條件下的好。該結(jié)果與酸性環(huán)境不利于顆石藻的鈣化，堿性有利于顆石藻的鈣化的特征吻合[19, 20]。

藻際細(xì)菌與藻類可能因為競爭營養(yǎng)物質(zhì)而抑制藻類的生長，藻際細(xì)菌生長過程中產(chǎn)生的代謝物及中間產(chǎn)物等可能對海洋藻類的光合作用和鈣化作用產(chǎn)生抑制作用[21]。假交替單孢菌是海洋藻類外生菌報道中常見種類，假交替單孢菌屬中的許多種類能產(chǎn)生胞外酶、胞外毒素、抗生素和胞外多糖、病毒活性等物質(zhì)[22-24]，在同多種海洋生物共生的過程中起到重要作用，并且對水華藻類有著明顯的抑制作用[25]。本實(shí)驗中，藻菌共培養(yǎng)體系中，雖然NPyS3能向堿性方向調(diào)整體系pH值，使得藻菌共同培養(yǎng)體系的pH值顯著升高達(dá)到10以上，但并未因為微環(huán)境酸化程度降低而減緩鈣化作用的受損。菌的介入使得顆石藻鈣化作用受到更強(qiáng)烈的抑制(P<0.01)，且菌對藻的抑制，遠(yuǎn)大于pH值降低對藻的影響。這是否因為假交替單孢菌的代謝產(chǎn)物抑制顆石藻的生長，或者細(xì)菌對顆石藻的資源性競爭抑制， 或由于NPyS3的參與，導(dǎo)致環(huán)境條件超過了藻類鈣化的最適范圍，進(jìn)而抑制藻類生長和鈣化；又或者因為細(xì)菌本身抑制了藻類對Ca2+的吸收利用，有待進(jìn)一步實(shí)驗驗證。

綜上所述，環(huán)境pH值對顆石藻的生長與鈣化都產(chǎn)生顯著影響，堿性條件比較有利于其增殖和鈣化；然而環(huán)境中拮抗生物因素對顆石藻生長及鈣化的抑制遠(yuǎn)大于pH值降低等環(huán)境因素的影響。

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