錢靜， 沈和定， 王成暖

(上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

精子是生物發(fā)生發(fā)育的基礎(chǔ)，是受精生物學中的重要研究內(nèi)容。研究精子形態(tài)結(jié)構(gòu)有助于受精機制的深入研究，促進人工繁殖工作的順利開展。此外，由于動物精子形態(tài)結(jié)構(gòu)具有種的特異性，可在一定程度上為研究物種間親緣關(guān)系和系統(tǒng)分類提供參考依據(jù)。精子頭部頂體的大小與形態(tài)，以及亞頂體腔的有無及其形態(tài)結(jié)構(gòu)等均可作為種間鑒別的依據(jù)。精核的形態(tài)，大小以及橫徑與縱徑的比例，核前窩與核后窩的有無及其結(jié)構(gòu)差異，精子中段線粒體數(shù)量及排列方式也是研究系統(tǒng)演化的重要依據(jù)，比較外形相似種的精子超微結(jié)構(gòu)之間的差異可為軟體動物的系統(tǒng)分類工作提供參考資料[1]。迄今，國內(nèi)外學者對腹足類軟體動物精子超微結(jié)構(gòu)已有較多研究[2-5]。

石磺科貝類隸屬軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、縮眼目(Systellommatophora)、石磺科(Onchidiidae)。廣泛分布于世界各地，主要生活于沿海潮間帶高潮區(qū)。目前國內(nèi)有關(guān)石磺科貝類的研究主要集中于形態(tài)分類，內(nèi)部解剖、人工繁殖及胚胎發(fā)育等方面[6-10]。對于石磺科貝類精子結(jié)構(gòu)的研究較為匱乏，僅應(yīng)雪萍等[11]研究了瘤背石磺(Onchidiumstruma)的精子超微結(jié)構(gòu)，其余種類石磺精子結(jié)構(gòu)至今未見報道。本文研究了平疣桑椹石磺(Platevindexmortoni)精子超微結(jié)構(gòu)，為其繁殖生物學及相關(guān)基礎(chǔ)研究積累資料；同時與瘤背石磺精子形態(tài)進行了比較，為石磺科分類工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

平疣桑椹石磺于2013年5—6月采自廣東湛江，樣品采集后立即帶回實驗室暫養(yǎng)。挑選活力好，成熟度高的個體置冰塊上進行活體解剖，迅速分離出生殖腺。

1.2 實驗方法

1.2.1 光鏡標本制作

解剖分離出兩性腺和支囊，切成1 mm3的小塊，放入Bouin氏液中常溫固定24 h。酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋(56～58℃)，Leica RM2016型切片機連續(xù)切片，切片厚度6 μm，蘇木素和伊紅雙重染色，中性樹膠封藏。另外取少量新鮮的成熟兩性腺和支囊，直接在載玻片上涂片，染色，Nikon-50i電光源顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.2 透射電鏡標本制作

將迅速分離出的兩性腺和支囊切成0.5 mm見方的小塊，用 0.1 mol/L、pH值7.4的磷酸緩沖液配制的3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定, 4℃保存?zhèn)溆谩９潭悠方?jīng)磷酸緩沖液充分漂洗，再用1%鋨酸后固定2 h，酒精-丙酮系列脫水，Epon812環(huán)氧樹脂浸透包埋，LKB-8800V超薄切片機切片, 切片厚度70 nm，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，日立H-7700型透射電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 光鏡的觀察

平疣桑椹石磺屬雌雄同體貝類，兩性腺濾泡既可產(chǎn)生精子也可產(chǎn)生卵子，屬于濾泡混合型，精卵發(fā)育不同時(圖1-1)。支囊中充滿精子，H.E染色后，精子頭部細胞核區(qū)藍色(圖1-2)。兩性腺中的精子成簇分布，頭部為球形(圖1-3)，精子束輸送至支囊后自動散開，頭部變成梭形或直線形(圖1-4)。

2.2 透射電鏡的觀察

平疣桑椹石磺精子為典型的進化型精子，包括頭部、中段和末段。

圖1 平疣桑椹石磺精子發(fā)育的形態(tài)結(jié)構(gòu)

1.兩性腺切片，示腺泡、次級精母細胞、成熟精子與卵原細胞 ×200；2.支囊中精子形態(tài) ×400；3.兩性腺中精子束，示球形頭部 ×400；4.支囊中精子散開，頭部呈梭形 ×400。SSC—次級精母細胞；S—精子；F—腺泡；OG—卵原細胞。

2.2.1 頭部

頭部長約4.5 μm，縱切面形態(tài)似辣椒，由頂體(acrosome)和精核(nucleus)構(gòu)成。

頂體位于頭部最前端，約為0.7 μm，似奶嘴狀，電子密度小且均勻。頂體基部內(nèi)凹形成圓弧形，與核前端相連，幾乎看不到間隙，外有質(zhì)膜包被(圖2-1)。

精核與頂體后端緊密相連，長約3.8 μm，寬約0.8 μm至1.2 μm，染色質(zhì)濃縮且均勻，電子密度較高，透射電鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)核泡的存在。細胞核前端平整，未形成核前窩(front nuclear pocket )，但核后端內(nèi)凹形成核后窩( posterior nuclear pocket )(圖2-2)。精子頭部與質(zhì)膜間往往有少量的細胞質(zhì)，質(zhì)膜(plasma membrane)呈波紋狀(圖2-3)。

2.2.2 中段

平疣桑椹石磺精子的中段緊接于核的后端，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。包括線粒體、中心粒、質(zhì)膜、類晶體物質(zhì)和糖原質(zhì)螺旋體等。

核后窩內(nèi)包含一對相互垂直的中心粒，與多數(shù)腹足綱貝類相似，近端中心粒(proximal centriole)長軸與精子長軸垂直，靠近細胞核；遠端中心粒(distal centriole)長軸與精子長軸方向一致(圖2-4)。通過精子前中段橫切面可清晰觀察到一圈由圓形顆粒構(gòu)成的類晶體層包裹著軸絲(axoneme) ，圖2-5。類晶體層外層為基質(zhì)層，縱切面觀基質(zhì)層較厚(圖2-6)。

糖原質(zhì)螺旋體(glycogen helix)內(nèi)含許多顆粒物質(zhì)，電子密度較高(圖2-7、8)?？v切面觀，糖原質(zhì)螺旋體呈細長囊泡狀，過精子前中段橫切面呈兩個圓形，其中一個糖原質(zhì)螺旋體隨中段往后逐漸變小，剩下的一個糖原質(zhì)螺旋體過中后段橫切面呈半圓形或彎月形(圖2-9、10)。

過精子中段縱切面可清晰看見線粒體演化成線粒體鞘，螺旋狀包繞軸絲(圖2-11、12)。

2.2.3 末段

平疣桑椹石磺精子末段結(jié)構(gòu)較為簡單，無糖原質(zhì)螺旋體和線粒體，橫切面呈圓形，能清晰看到內(nèi)部軸絲呈典型的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖2-13)。

3 討論

3.1 腹足綱貝類精子超微結(jié)構(gòu)的比較

腹足綱貝類精子分為原始型和進化型兩種。原始型精子頭部呈錐形，中段較短，有4～5個線粒體，無線粒體鞘(chondriosomal mantle)結(jié)構(gòu)；進化型精子頭部呈線形，中段加長，線粒體演化成線粒體鞘結(jié)構(gòu)包圍中心粒排列[12]。通過比較9種腹足綱貝類的精子超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同科貝類精子形態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大，如表1所示。

原始腹足類的角蠑螺(Turbocornutus)頂體呈啤酒瓶狀[13]；塔形馬蹄螺(Trochuspyramis)頂體呈圓錐形[4]；鮑類頂體呈圓錐狀或彈頭狀；而新腹足目的香螺(Npatunedecumingi)[12]則無頂體結(jié)構(gòu)?？梢?，不同種貝類精子的頂體發(fā)達程度及形態(tài)結(jié)構(gòu)均存在較大差異。

原始腹足目角蠑螺和塔形馬蹄螺精核呈長柱形，均有明顯的核前窩與核后窩結(jié)構(gòu)[4, 13]；皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)的精子核呈長柱狀，核前窩凹陷較深呈V字型，但核后端凹陷較淺[14]。肺螺類的瘤背石磺精子[11]與本文研究的平疣桑椹石磺精子均有明顯核后窩卻無核前窩?？梢娋顺诵螒B(tài)結(jié)構(gòu)差異外，核前窩與核后窩的有無也是作為種間區(qū)別的重要依據(jù)。

原始腹足目的角蠑螺[13]、塔形馬蹄螺[4]與盤鮑(Haliotisdiscus)精子中段有5個線粒體；皺紋盤鮑與雜色鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)精子中段有5～6個線粒體[14]。新腹足目的疣荔枝螺(Purpuraclavigera)的精子中段線粒體均螺旋化，肺螺亞綱的瘤背石磺精子與本文研究的平疣桑葚石磺精子中段線粒體均為5個，螺旋化形成線粒體鞘包繞在軸絲外。

表1 9種腹足綱貝類精子超微結(jié)構(gòu)比較

3.2 同科不同種貝類精子結(jié)構(gòu)差異比較

對比發(fā)現(xiàn)同科不同種貝類的精子形態(tài)差異不是很大，但在體尺參數(shù)、頂體形態(tài)、精核形態(tài)、線粒體數(shù)目等方面存在或大或小的差異。例如，柯才煥等[14]研究的3種鮑精子的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)鮑類精子形態(tài)的基本結(jié)構(gòu)是相似的，但頂體和核的尺寸及外形上有著或大或小的差異。盤鮑與皺紋盤鮑的精子在外形較為相似，卻明顯長于雜色鮑。盤鮑精子頂體長度大于皺紋盤鮑大于雜色鮑，雜色鮑的頂體呈圓錐狀，頂端較尖，而皺紋盤鮑和盤鮑的頂體呈圓柱狀，頂端較鈍。盤鮑頂體下腔的內(nèi)凹較深，雜色鮑次之，皺紋盤鮑最淺。

圖3 瘤背石磺與平疣桑椹石磺頭部縱切示意圖

1.瘤背石磺精子頭部縱切；2.圖右為平疣桑椹石磺精子頭部縱切。A—頂體；N—精核；PM—質(zhì)膜；PC—近端中心粒；DC—遠端中心粒；Nv—核泡。

對比瘤背石磺精子結(jié)構(gòu)與本文研究的平疣桑椹石磺精子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)兩種精子中段和末段均相似，但頭部差異較大(圖3)。瘤背石磺頂體0.8 μm，與核前端有間隙，精核4.2 μm，前端較窄約0.29 μm，后端較寬約0.96 μm；而平疣桑葚石磺頂體0.7 μm，與核前端無間隙，精核長約3.8 μm，前后端直徑相差不大，前端稍窄，寬度約為0.8 μm，后端寬約1.2 μm。瘤背石磺精子頂體呈典型奶嘴狀，頂體囊內(nèi)電子密度稍低于頂體構(gòu)架體；平疣桑椹石磺精子頂體奶嘴狀形態(tài)不明顯，頂體囊與頂體構(gòu)架體內(nèi)電子密度無明顯差異。兩種石磺精子間最明顯的區(qū)別是瘤背石磺精核存在一些大小不等的核泡，而平疣桑椹石磺精核電子密度高，未發(fā)現(xiàn)核泡的存在。有學者推測精核中的囊泡可能攜帶了由線粒體釋放出的能量，由核區(qū)向頂部運動，起到能量運輸或傳遞的作用[1]。關(guān)于核泡的來源及其意義仍待進一步研究。

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