楊林穎, 馬 瑞, 翟 楠, 倪 兵, 顧福康

(1. 華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 上海 200062；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系公共技術(shù)平臺(tái)電鏡室， 上海 200025)

納米二氧化鈦(TiO2)是目前應(yīng)用最廣泛的納米材料之一，在光催化性、光吸收性、可塑性等方面表現(xiàn)出的特點(diǎn)已使其在化妝品、涂料、空氣凈化、殺菌消毒等領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。由于納米TiO2能隨著產(chǎn)品經(jīng)呼吸、皮膚接觸、消化道等不同途經(jīng)進(jìn)入生物體內(nèi)，因而其潛在安全性問(wèn)題已引起了人們的關(guān)注。目前對(duì)納米TiO2生物組織毒性和細(xì)胞毒性的研究主要集中于高等動(dòng)物組織或細(xì)胞[4-5]，而納米TiO2對(duì)原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)的毒性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。原生動(dòng)物是最簡(jiǎn)單、最原始的單細(xì)胞真核生物，且生活壞境的細(xì)微變化都可引起其細(xì)胞形態(tài)及生活狀態(tài)的改變，因而一直以來(lái)都是細(xì)胞學(xué)研究和環(huán)境測(cè)評(píng)的良好材料。

本研究應(yīng)用透射電子顯微術(shù)觀(guān)察了納米TiO2對(duì)原生動(dòng)物闊口游仆蟲(chóng)(Euploteseurystomus)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為深入探索納米TiO2的細(xì)胞毒性及毒性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組

闊口游仆蟲(chóng)采自上海郊區(qū)某池塘，經(jīng)分離純化后，用麥粒發(fā)酵液培養(yǎng)的鞭毛蟲(chóng)草履唇滴蟲(chóng)(Chilomonasparamecium)喂食培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20℃。

納米TiO2(5 nm、25 nm)購(gòu)自Degussa公司，120℃高溫滅菌2 h后，用雙蒸水配置成1 mg/mL的顆粒懸浮母液，用數(shù)控超聲波儀在300 W、25℃條件下解聚30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

實(shí)驗(yàn)共分為5 nm組、25 nm組和對(duì)照組3組，每組均加入50只生長(zhǎng)狀態(tài)良好的闊口游仆蟲(chóng)。處理組分別對(duì)應(yīng)加入5 nm 和25 nm TiO2母液使其在培養(yǎng)液中終濃度為100 μg /mL，對(duì)照組則用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。24 h后取樣制備透射電鏡樣品。

1.2 透射電鏡制樣及觀(guān)察

24 h后收集各組闊口游仆蟲(chóng)，并參照顧福康等[6]和Arregui等[7]報(bào)道的方法，做適當(dāng)修改后制備透射電鏡樣品：1%的鋨酸與2.5%的戊二醛(1∶1)混合液4℃下固定10 min， 0.1 mol/L PBS漂洗3次；1%鋨酸4℃下固定1 h，PBS洗滌3次后，用梯度丙酮脫水、包埋聚合，超薄切片后進(jìn)行醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，于透射電鏡(日立HT 7700)下觀(guān)察。

2 結(jié)果

納米TiO2解聚后分散效果良好(圖1)。

圖1 5 nm(A)和25 nm(B)TiO2解聚后的分散相

圖2 正常闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

A—腹表膜下微管層； B—背表膜下微管層； C—細(xì)胞核； D—線(xiàn)粒體； E—內(nèi)含線(xiàn)粒體的自噬泡(P質(zhì)膜， A表膜泡， N細(xì)胞核， Mit線(xiàn)粒體)。

2.1 正常闊口游仆蟲(chóng)的超微結(jié)構(gòu)

對(duì)照組中，闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞被覆表膜，表膜由質(zhì)膜、表膜泡外膜和表膜泡內(nèi)膜3層膜組成。表膜下分布有各種微管類(lèi)細(xì)胞骨架，其中包括由單根微管間隔排列而成的腹表膜下微管層(圖2-A)，及由倒“品”字形微管單元間隔排列而成的背表膜下微管層(圖2-B)，每個(gè)倒“品”字形微管單元含3根微管。細(xì)胞質(zhì)致密，少見(jiàn)無(wú)結(jié)構(gòu)基質(zhì)。細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，核膜清晰，核內(nèi)含許多顆粒狀的核仁，染色質(zhì)呈大小不等的顆粒狀或塊狀，電子密度高于核仁(圖2-C)。線(xiàn)粒體呈球形或橢球形，形態(tài)規(guī)則，內(nèi)外膜清晰，內(nèi)膜內(nèi)凹形成大量管狀或片層狀的嵴(圖2-D)。細(xì)胞內(nèi)有各級(jí)消化泡及自噬泡，消化泡內(nèi)有不同消化程度的食物顆粒，自噬泡內(nèi)含有被吞噬的細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)如解體的線(xiàn)粒體等胞器(圖2-E)。

2.2 納米TiO2在闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)

處理組細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)了電子密度較高的納米TiO2顆粒，納米TiO2主要以聚集狀存在于闊口游仆蟲(chóng)的消化泡(圖3-A、B)和自噬泡中(圖3-C)，也可由單層或多層膜包裹或無(wú)膜包被直接散步于胞質(zhì)或胞器等結(jié)構(gòu)(圖3-D)。

圖3 納米TiO2在闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)

2.3 處理組闊口游仆蟲(chóng)的超微結(jié)構(gòu)

納米TiO2能直接穿破核膜(圖4-A、B)及線(xiàn)粒體膜(圖4-C)，從而對(duì)細(xì)胞核和線(xiàn)粒體造成直接或間接的損傷。

圖4 聚集的納米TiO2直接穿破核膜及線(xiàn)粒體膜

(B為A中黑框區(qū)域的放大)

經(jīng)不同粒徑納米TiO2處理后，闊口游仆蟲(chóng)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的損傷：1) 25 nm TiO2處理組的細(xì)胞核核仁變少，染色質(zhì)出現(xiàn)較多空洞(圖5-A)或碎裂成許多小塊(圖5-B)；線(xiàn)粒體外膜受損，與胞質(zhì)界限模糊(圖5-D)。2) 5 nm TiO2處理組的細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)不如對(duì)照組致密，整個(gè)細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡化，細(xì)胞內(nèi)多處出現(xiàn)多層膜狀結(jié)構(gòu)(圖5-F)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖5-G)，部分膜狀結(jié)構(gòu)正在包圍納米材料(圖3-D)；細(xì)胞核核仁消失，染色質(zhì)濃縮聚集成大且不規(guī)則的團(tuán)塊狀(圖5-C)；線(xiàn)粒體變形，局部凹陷，嵴瓦解，線(xiàn)粒體腔內(nèi)有斷裂的嵴碎片(圖5-E)，且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量線(xiàn)粒體被自噬泡吞噬消化的現(xiàn)象。

圖5 處理組闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

(A、B—25 nm TiO2處理組細(xì)胞核； C—5 nm TiO2處理組細(xì)胞核； D—25 nm TiO2處理組線(xiàn)粒體； E—5 nm TiO2處理組線(xiàn)粒體； F—5 nm TiO2處理組細(xì)胞內(nèi)大量的多層膜狀結(jié)構(gòu)； G—5 nm處理組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng))。

另外，各處理組背表膜下微管層連續(xù)出現(xiàn)倒“品”字形微管單元各缺失兩根微管的現(xiàn)象(圖6-A)，腹表膜下微管層也出現(xiàn)局部微管缺失的現(xiàn)象(圖6-B)，細(xì)胞表膜下不再形成間隔一致有序的背腹表膜下微管層。

圖6 處理組闊口游仆蟲(chóng)的背(A)腹(B)表膜下微管層

3 討論

3.1 納米TiO2進(jìn)入闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞的方式

關(guān)于納米TiO2侵入細(xì)胞方式的報(bào)道已有很多，其最常見(jiàn)的侵入方式為胞吞[8]，也有報(bào)道納米TiO2可直接穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞表膜破損及表膜直接內(nèi)吞納米顆粒的現(xiàn)象，但在闊口游仆蟲(chóng)的各級(jí)消化泡中觀(guān)察到有納米TiO2的存在，推測(cè)納米TiO2是經(jīng)口通過(guò)闊口游仆蟲(chóng)的攝食進(jìn)入細(xì)胞的。這可能與實(shí)驗(yàn)材料本身的特點(diǎn)有關(guān)，闊口游仆蟲(chóng)屬高等單細(xì)胞原生動(dòng)物，表膜由3層膜構(gòu)成，結(jié)構(gòu)厚實(shí)致密，表膜下又有復(fù)雜的微管類(lèi)細(xì)胞骨架，故納米TiO2很難通過(guò)穿膜或內(nèi)吞途徑進(jìn)入闊口游仆蟲(chóng)。

3.2 納米TiO2對(duì)闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)納米TiO2對(duì)闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響是多方面的。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)納米TiO2可直接穿破核膜及線(xiàn)粒體膜，導(dǎo)致二者超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，如細(xì)胞核核仁減少、染色質(zhì)聚集濃縮及線(xiàn)粒體腫脹變形、外膜受損、內(nèi)膜嵴狀結(jié)構(gòu)斷裂瓦解等，這與前人關(guān)于納米TiO2對(duì)細(xì)胞的靶作用部位及損傷效應(yīng)的描述較為相似[11-13]。細(xì)胞核和線(xiàn)粒體等胞器的損傷，可能影響到細(xì)胞內(nèi)微管基因的表達(dá)及能量的供應(yīng)，進(jìn)而阻礙微管蛋白的合成組裝，導(dǎo)致闊口游仆蟲(chóng)背腹表膜下的微管層出現(xiàn)局部缺失。另外，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，多層膜性結(jié)構(gòu)以及大量只在特殊生理狀態(tài)下才可見(jiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的出現(xiàn)，均表明納米TiO2對(duì)闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷是廣泛的，并且細(xì)胞在多種胞器受損、生命活動(dòng)受阻的情況下，產(chǎn)生了諸如形成膜物質(zhì)包圍納米材料的防御機(jī)制。

3.3 納米TiO2對(duì)細(xì)胞損傷的粒徑效應(yīng)

目前很多分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納米TiO2對(duì)細(xì)胞的損傷具有粒徑效應(yīng)[14]，即粒徑越小，對(duì)細(xì)胞的毒性作用越大，而從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面去證實(shí)納米材料的粒徑效應(yīng)鮮有報(bào)導(dǎo)，本研究電鏡結(jié)果表明納米TiO2對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷確實(shí)表現(xiàn)出粒徑效應(yīng)。這可能是由于隨著納米顆粒粒徑的減小，其比表面積增大，表面電子受體和供體活動(dòng)位點(diǎn)增多，表面能和表面張力也急劇增加，從而表現(xiàn)出更加活躍的理化性質(zhì)[15]。另外，在闊口游仆蟲(chóng)細(xì)胞中，小粒徑的納米顆?？赡芫哂懈鼜?qiáng)的穿膜能力及轉(zhuǎn)移活性[16]，從而表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)更為嚴(yán)重的影響和損傷。

綜上所述，納米TiO2可直接穿過(guò)核膜及線(xiàn)粒體膜，導(dǎo)致闊口游仆蟲(chóng)的細(xì)胞核及線(xiàn)粒體受損，進(jìn)而影響到細(xì)胞內(nèi)各種活動(dòng)功能的正常運(yùn)行。但關(guān)于納米TiO2對(duì)細(xì)胞器的具體損傷機(jī)制以及闊口游仆蟲(chóng)對(duì)納米TiO2的防御機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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