楊雪玲， 張秋芳， 陳 瑤， 周陽靖， 程軍蕊， 鄭琦宏， 徐繼榮

(寧波大學(xué) 建筑工程與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

城市內(nèi)河是城市生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，隨著寧波市工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加速，城市人口不斷增加，大量工業(yè)、生活污水排入，加之內(nèi)河河網(wǎng)位于水系末端, 入江閘門經(jīng)常關(guān)閉, 河道內(nèi)水流基本凝滯, 極易造成水質(zhì)惡化, 主要城區(qū)內(nèi)河河網(wǎng)水質(zhì)較差，大多數(shù)為Ⅳ～劣Ⅴ類[1-4]。許多疾病如：傷寒、霍亂和腹瀉等疾病皆可由水域中的致病細(xì)菌傳播引起，威脅著人類的健康[5-6]。處于嚴(yán)重富營養(yǎng)化狀態(tài)的寧波市城區(qū)內(nèi)河，極易造成痢疾桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌和大腸桿菌等各種病原菌的滋生和傳播。

由于采用埃希氏大腸桿菌作為糞便污染的指示生物傳統(tǒng)方法，雖然簡單、直觀和廉價但并未完全包括了與其它與水域傳染疾病關(guān)系密切的志賀氏痢疾桿菌、霍亂弧菌和沙門氏菌等病原菌，應(yīng)用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測方法已無法為水體安全性評價提供可靠依據(jù)。最近，美國環(huán)境保護(hù)部(USEPA)已將實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)方法做為一種可供選擇的快速檢測方法用于娛樂用水區(qū)域的水體質(zhì)量管理。[7]。定量PCR方法已應(yīng)用于城市河流病原菌檢測[6]。因此，具快速、高特異性及靈敏等特點(diǎn)的qPCR方法，已經(jīng)成為檢測環(huán)境中病原菌含量的一種有效方法[5， 8]。劉永軍等[9-11]設(shè)計(jì)的病原菌特異引物已成功地應(yīng)用于檢測水體中的病原菌，為定量分析水環(huán)境中病原菌含量提供了重要方法。

本研究擬采集寧波市內(nèi)河不同點(diǎn)位水體，應(yīng)用定量PCR方法結(jié)合常規(guī)水質(zhì)分析，分析城區(qū)內(nèi)河水體病原菌含量現(xiàn)狀及其與水質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期為城市內(nèi)河水體病原菌的評價和監(jiān)控提供一種快速而準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

1.2 主要水質(zhì)指標(biāo)分析

碘量法測定溶解氧(DO)含量(GB7489-89)；高錳酸鹽法分析(CODMn)(GB11892-89)；堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定總氮(TN)含量(GB11894-89)；納氏試劑比色法分析氨氮(NH4+-N)含量(GB7479-87)；鉬酸銨分光光度法分析總磷(TP)含量(GB11893-89)；葉綠素a方法參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》。

1.3 定量PCR檢測方法

1.3.1 樣品總DNA提取

參照Winter等[12]方法，取300 mL新鮮水體，經(jīng)0.22 μm親水濾膜(GVWP04700， Millipore, USA)進(jìn)行抽真空過濾，將濾紙用酒精燈消毒后的剪刀剪碎后，應(yīng)用FastDNA Spin Kit for Soil (Qbiogene, Carlsbad, CA, USA)試劑盒，具體提取方法按照說明書并略加修改，核酸提取儀(Qbiogene公司, 美國)均質(zhì)條件為18 s，4.5 m s-1，將獲得的總DNA用70 μL DES溶液收集，并用NanoDrop-1000 超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)進(jìn)行含量和純度測定后，儲存于-20°C下備用。

1.3.2 定量PCR分析

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

采用劉永軍等[9]等設(shè)計(jì)的引物，即根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因的高度保守性，針對志賀氏痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)，霍亂弧菌(Vibriocholerae)，沙門氏菌(Salmonellatyphrmurium)和埃希氏大腸桿菌(Escherichiacoli) 4種病原菌設(shè)計(jì)的強(qiáng)特異性通用引物。病原菌引物正向序列為：5′-AAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC-3′(240-280 bp,E.coli16S rRNA)和反向序列：5′-GCTTGCCAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTTGAGC-3′(521-556 bp,E.coli16S rRNA)[9]。在50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系里包含：1×PCR緩沖液(Fermentas, Canada), MgCl2為3.0 mM, 每種dNTP為400 μM (Fermentas, Canada), 2.5 U Taq DNA 聚合酶 (Fermentas, Canada), 0.2 mg mL-1牛血清蛋白 (BSA)，加入每個引物濃度至0.2 mM, 最后加入1μL水體總基因組DNA溶液作為模板。PCR反應(yīng)程序，參照劉永軍等方法[9]并略加修改：94°C 5 min, 接著30個循環(huán)為：變性94°C 30 s，退火55°C 30 s，延伸72°C 30 s，最后72°C 5 min，并用滅菌雙蒸水代替DNA模板設(shè)為陰性對照。用1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠加核酸染料染色檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)成像，拍照，片段大小為380 bp左右。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物回收純化后，再用PMD19-T (TaKaRa, 大連寶生)載體進(jìn)行鏈接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α，涂布到含有氨芐青霉素/IPTG/X-Gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃下培養(yǎng)16 h，并設(shè)置對照。隨機(jī)選取一定數(shù)量的白色陽性克隆子，經(jīng)液體培養(yǎng)后送至公司進(jìn)行序列測定(上海英駿公司)。將測定的目的基因片段序列，在Genebank中與已知序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

取上述一已知序列病原菌基因的質(zhì)粒作為定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板，質(zhì)粒提取使用MiniBEST Plasmid Purification Kit(TaKaRa, Japan)試劑盒依照生產(chǎn)商說明的方法提取，將提取到的質(zhì)粒用超微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop)檢測其含量和純度，用10倍梯度稀釋已知拷貝數(shù)基因片段作為模板，共設(shè)7個濃度，從1.47 × 103到1.47 × 109拷貝數(shù)μL-1。

2)定量 PCR反應(yīng)體系及程序

應(yīng)用1.3.2中引物[9]對病原菌進(jìn)行定量分析。定量PCR反應(yīng)在ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR分析儀(Applied Biosystems, USA)中進(jìn)行。反應(yīng)體系為25 μL，其中包含1 μL模板DNA，12.5 μL FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche, Switzerland)，引物各200 mM，0.2 mg/mL BSA反應(yīng)在200 μL平頂定量PCR管中進(jìn)行。反應(yīng)條件：50°C 2 min, 95°C 10 min, 接著40個循環(huán)為：95°C 15 s，55°C 10 min，于82°C進(jìn)行熒光信號收集。為檢測定量PCR產(chǎn)物的特異性，用1.2%瓊脂凝膠電泳檢測，觀察到基因片段約為320 bp，無明顯二聚體。試驗(yàn)過程中皆設(shè)不加DNA模板的陰性對照。DNA提取物的抑制物對定量PCR影響的分析測定結(jié)果表明，提取物中可能存在的雜質(zhì)對定量PCR反應(yīng)沒有抑制作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 軟件(16.0 版)，采用Duncan法進(jìn)行不同點(diǎn)位間水質(zhì)指標(biāo)單因素差異分析(ANOVA)，采用皮爾遜相關(guān)(Pearson Correlation)分析病原菌基因含量與水質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)指標(biāo)

主要水質(zhì)指標(biāo)分析結(jié)果如表1所示?？芍?，寧波市城區(qū)不同內(nèi)河水質(zhì)有所差異。根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[3]，所采集水樣的水質(zhì)指標(biāo)中，祖關(guān)山河和南北河的DO含量顯著地高于蘇家河、后西河、史魏家河和直落河，且蘇家河、后西河、史魏家河和直落河的DO皆屬于劣Ⅴ類；所有供試內(nèi)河的總氮、氨氮和總磷也都屬于劣Ⅴ類。后西河、史魏家河和直落河的總氮、氨氮、總磷和電導(dǎo)率皆明顯地高于祖關(guān)山河、南北河和蘇家河。蘇家河的電導(dǎo)率、總氮、氨氮、濁度、總磷和CODMn的值皆低于其它河流。另外，后西河的透明度最高，而直落河的最低；后西河和直落河的溫度最高；pH值都在6～9之間；后西河葉綠素a含量最高，其次是史魏家河，而祖關(guān)山河和南北河的較低。

由此可見，寧波市區(qū)主要內(nèi)河皆處于嚴(yán)重富營養(yǎng)化狀態(tài)，這可能由于寧波市內(nèi)河河網(wǎng)位于水系末端, 入江閘門經(jīng)常關(guān)閉, 河道內(nèi)水流基本凝滯，極易造成水質(zhì)惡化而導(dǎo)致城區(qū)河網(wǎng)水質(zhì)基本屬于Ⅳ～劣Ⅴ類[4, 14]。從表1中還可以看出，由于生活污水長期直接排入，使得屬于典型城中村區(qū)域的史魏家河等水體質(zhì)量特別差，DO含量最低，總氮、氨氮和濁度等含量也高，這些因素都可能為河道病原菌的滋生提供良好的環(huán)境，應(yīng)屬于需要重點(diǎn)監(jiān)控的區(qū)域。

圖1 寧波市內(nèi)河病原菌基因含量

其中：1、2、3、4、5和6分別表示祖關(guān)山河、蘇家河、南北河、后西河、史魏家河和直落河采樣點(diǎn)。

表1 寧波城區(qū)主要內(nèi)河主要水體指標(biāo)

a—平均值(n=3)； 同一列字母相同差異不顯著；P<0.05時差異達(dá)顯著水平，用小寫字母表示。

2.2 水體腸道菌基因定量PCR分析

用于制作定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)為：擴(kuò)增效率在96.3%，相關(guān)性指數(shù)R2為0.998，斜率為-3.41，這些標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)指標(biāo)皆滿足定量PCR分析的要求[15-16]。

從圖1可知，各采樣點(diǎn)每升水體的病原菌基因的拷貝數(shù)分別為：祖關(guān)山河3.34 × 105，蘇家河1.47 × 105，南北河4.68 × 105，后西河1.75 × 106，史魏家河9.65 × 10和直落河1.33 × 106。史魏家河含量顯著高于其它供試河流，其次是后西河和直落河，而祖關(guān)山河、南北河和蘇家河較低，且三者之間無顯著差異。

根據(jù)劉永軍等[10-11]應(yīng)用濾膜過濾法(MF)和定量PCR法對黑河水體的腸桿菌數(shù)量分析比較表明，通用引物定量PCR方法檢測水體腸桿菌基因的含量所獲得的檢測值是傳統(tǒng)MF法所得的大腸桿菌菌落數(shù)量的5倍，且兩者呈顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，根據(jù)本試驗(yàn)應(yīng)用定量PCR方法所獲得的寧波城區(qū)各供試內(nèi)河腸桿菌基因的拷貝數(shù)，可將其換算為大腸桿菌菌落數(shù)分別為：祖關(guān)山河67000個/L，蘇家河29400個/L，南北河93000個/L，后西河350000個/L，史魏家河1930000個/L和直落河266000個/L。根據(jù)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，除蘇家河的大腸桿菌含量為29400個/L小于Ⅴ類地表水糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)限值小于40000個/L外，其它的河流地表水糞大腸菌群皆大于40000個/L，屬于劣Ⅴ類水質(zhì)范圍。而從表2水質(zhì)指標(biāo)分析可知，本次供試驗(yàn)內(nèi)河水體多屬于劣Ⅴ類，因此，本研究應(yīng)用定量PCR方法所獲得的病原菌基因的含量經(jīng)換算成大腸桿菌的量后用于評價水質(zhì)與主要水體理化指標(biāo)所得的結(jié)論相接近。

但是，研究中提取的水體總DNA包括了死細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞，因此，應(yīng)用定量PCR方法所測得的病原菌含量可能與水體中具生命力的病原菌數(shù)量有所偏差。同時，微生物多樣性具有地域性特點(diǎn)，且不同水質(zhì)環(huán)境中4種病原菌的比例及具體種類可能也不相同[17]。因此，在進(jìn)行水體病原菌定量PCR檢測時，還必須同時與傳統(tǒng)濾膜培養(yǎng)法相結(jié)合，進(jìn)行綜合考慮，分析和計(jì)算出水體中病原菌的數(shù)量與種類及其與生長環(huán)境因子相關(guān)的模型[18]，并建立地區(qū)病原菌相應(yīng)的基因庫，才能對水環(huán)境中的病原菌進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和預(yù)測提供更可靠依據(jù)[7， 16]，這也是有待于今后進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

2.3 水體腸道菌含量與水質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析

內(nèi)河水體中腸道病原菌含量與水質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析可得：腸道病原菌含量分別與內(nèi)河水體溶氧量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.611,n=18,p=0.007< 0.01)；與內(nèi)河水體總氮(r=0.626,n=18,p=0.005< 0.01)、氨氮(r=0.706,n=18,p=0.001< 0.01)、濁度(r=0.662,n=18,p=0.003< 0.01)、總磷(r=0.559,n=18,p=0.016< 0.05)、CODMn(r=0.577,n=18,p=0.012< 0.05)、葉綠素a(r=0.494,n=18,p=0.037< 0.05)含量和電導(dǎo)率(r=0.632,n=18,p=0.005< 0.01)呈顯著正相關(guān)；與水體透明度(r=-0.065,n=18,p=0.799>0.05)、溫度(r=0.245,n=18,p=0.327>0.05)和酸堿度(r=-0.396,n=18,p=0.104>0.05)無明顯相關(guān)。由于水體為微生物的生長和繁殖提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和基本環(huán)境條件，因此水體中環(huán)境因子是影響病原菌存在的重要因素[18]。研究表明了內(nèi)河中的腸道菌含量與水體中的溶解氧、總氮、氨氮、濁度、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、葉綠素和電導(dǎo)率等因子密切相關(guān)，但并未受水體透明度、溫度和酸堿度的影響。

3 結(jié)論

本研究說明qPCR方法是水體病原菌的檢測的一種有效的方法，由于傳統(tǒng)的濾膜過濾法(MF)無法檢測到與水域傳染疾病關(guān)系密切的志賀氏痢疾桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌等病原菌，因此，qPCR方法是傳統(tǒng)濾膜過濾培養(yǎng)方法的一個重要補(bǔ)充，兩種方法相結(jié)合可望為寧波市城區(qū)內(nèi)河水體病原菌安全性評價提供了一個快速而全面的檢測技術(shù)體系，為確保城市內(nèi)河生態(tài)安全提供了一個重要依據(jù)。

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