錢柿汝， 袁久剛， 姚金龍， 樊正國(guó)， 盧榮清， 王 強(qiáng)， 范雪榮

(1. 江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江蘇聯(lián)發(fā)紡織股份有限公司 江蘇省生態(tài)染整技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 海安 226601)

眾所周知，聚乙烯醇(PVA)和聚丙烯酸(PAA)均為比較重要的紡織上漿材料。PVA漿料具有很多優(yōu)點(diǎn)，如黏度穩(wěn)定、粘著力強(qiáng)、成膜性好、漿膜強(qiáng)度較大，彈性伸長(zhǎng)、耐磨性和耐屈曲性好等，且其上漿性能優(yōu)于原淀粉和變性淀粉。PAA漿料對(duì)親水性纖維有良好的黏附性，能改善淀粉漿料的粘度熱穩(wěn)定性[1]。

經(jīng)紗上漿織造成織物后需要退漿，α-淀粉酶可迅速將淀粉大分子降解成糊精、麥芽糖和葡萄糖等水溶性物質(zhì)，將織物(經(jīng)紗)上的淀粉漿料快速去除，具有能耗低、排污少、廢水處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。此外，由于酶的專一性，淀粉酶退漿較堿退漿織物強(qiáng)力損傷小，因此淀粉酶退漿被印染企業(yè)廣泛采用。但酶對(duì)反應(yīng)環(huán)境的要求苛刻，對(duì)環(huán)境的變化敏感。當(dāng)反應(yīng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，其構(gòu)象和活力都會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致其催化效率發(fā)生變化。研究表明，一些小分子多元醇[4]和表面活性劑[5-6]等低分子量物質(zhì)和聚乙二醇、聚乙烯胺[7-8]等高聚物均會(huì)對(duì)酶的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境等造成一定的影響，這些影響可以通過(guò)酶內(nèi)氨基酸的內(nèi)源性熒光及酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化予以分析。大多數(shù)的酶分子中都含有芳香族氨基酸，色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)這3類氨基酸均同屬于這一類氨基酸，這3類氨基酸所具有的的熒光特性之所以不同，主要是因?yàn)樗鼈兊膫?cè)鏈基團(tuán)不同。這3類氨基酸所具有的熒光強(qiáng)度排列依次為：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。在現(xiàn)有的酶構(gòu)象研究中，往往會(huì)根據(jù)芳香族氨基酸的熒光特性來(lái)推測(cè)酶分子的構(gòu)象以及微環(huán)境的變化。Trp殘基不但對(duì)微環(huán)境變化非常敏感，而且它在大部分蛋白質(zhì)中的數(shù)量均較多，因此，往往選用Trp殘基作為酶分子的內(nèi)源性熒光探針，來(lái)反映處于不同環(huán)境下酶分子構(gòu)象和微環(huán)境變化的信息。在淀粉酶退漿過(guò)程中，漿料組分中PVA/PAA的存在對(duì)淀粉酶的酶活、構(gòu)象等有何影響，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本文研究了PVA/PAA對(duì)α-淀粉酶的活性、內(nèi)源性熒光及二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

玉米原淀粉，山東鄒平天美紡織助劑有限公司；PVA-1799、PAA均為工業(yè)品，江蘇聯(lián)發(fā)紡織股份有限公司；α-淀粉酶(諾維信中溫α-淀粉酶)，酶活120000 U/mL，上海諾維信生物技術(shù)有限公司；3, 5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、甘油、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2802S紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼科儀器有限公司；F-4600熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；DOS-450圓二色譜儀，法國(guó)Bio-Logic公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-淀粉酶活力測(cè)定

α-淀粉酶的活力采用DNS比色法測(cè)定[9]。1 mL適當(dāng)濃度的酶液在60 ℃、pH值6的條件下，1 min分解產(chǎn)生1 μmol還原糖為一個(gè)活力單位(1 U)。在不同PVA、PAA濃度時(shí)測(cè)定α-淀粉酶的活力，PVA的濃度分別為5%、15%和25%，PAA的濃度分別為1.5%、2%和2.5%，以未加PVA、PAA的α-淀粉酶活力為100%。

1.2.2 熒光光譜的測(cè)定

在α-淀粉酶的0.1 M磷酸鹽緩沖溶液中分別加入不同濃度的PVA或PAA溶液，PVA的濃度分別為5%、15%和25%，PAA的濃度分別為1.5%、2%和2.5%，混合均勻，25℃下以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。熒光發(fā)射譜的背景散射用緩沖溶液校正。

1.2.3 圓二色譜的測(cè)定

在α-淀粉酶的0.1 M 磷酸鹽緩沖溶液中分別加入不同濃度的PVA或PAA溶液，PVA的濃度分別為5%、15%和25%，PAA的濃度分別為1.5%、2%和2.5%，α-淀粉酶的濃度為0.01 g/L，混合均勻后，在25 ℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下于190～260 nm范圍內(nèi)掃描圓二色譜。圓二色譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為deg·cm2/dmol，二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算采用K2D方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 PVA/PAA對(duì)α-淀粉酶活性的影響

在α-淀粉酶水解體系中，分別加入不同濃度的PVA或PAA，其酶活性變化如圖1和圖2所示。

圖1 不同濃度PVA對(duì)α-淀粉酶活性的影響

圖2 不同濃度PAA對(duì)α-淀粉酶活性的影響

從圖1、圖2可以看出，PVA或PAA均使得α-淀粉酶的活性降低，且PVA或PAA的濃度越高，酶活性降低越多。這可能是PVA或PAA會(huì)使得酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生扭曲，使酶活性逐漸降低。為了進(jìn)一步研究α-淀粉酶活性降低的原因，本文分別采用熒光色譜法和圓二色譜法研究了PVA/PAA對(duì)α-淀粉酶內(nèi)源性熒光及對(duì)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

2.2 PVA/PAA對(duì)α-淀粉酶內(nèi)源性熒光的影響

PVA/PAA的濃度對(duì)α-淀粉酶的內(nèi)源性熒光的影響如圖3和圖4所示。

圖3 PVA濃度對(duì)α-淀粉酶內(nèi)源性熒光的影響

a-d: PVA的濃度依次為0%、5%、15%和25%。

圖4 PAA濃度對(duì)α-淀粉酶內(nèi)源性熒光的影響

a-d: PAA的濃度依次為0%、1.5%、2%和2.5%。

由圖3可知，PVA濃度的增強(qiáng)使得α-淀粉酶的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度也會(huì)稍有增強(qiáng)。這一現(xiàn)象表明可能是PVA使α-淀粉酶芳香氨基酸殘基周圍環(huán)境的極性減小[10]，或者是α-淀粉酶的空間結(jié)構(gòu)由于PVA的作用而變得松散，使得原處于淀粉酶分子內(nèi)疏水腔中的色氨酸(Trp)暴露在α-淀粉酶分子的表面，進(jìn)而熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[11]。此外，在PVA溶液中，色氨酸殘基的吲哚基團(tuán)上的-N-H可能會(huì)與PVA分子中帶有的羥基形成分子間氫鍵，使得熒光體的結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，受激發(fā)后產(chǎn)生π→π*躍遷，熒光量子效率增大，熒光增強(qiáng)[11]。由圖4可知，PAA的濃度越大，熒光強(qiáng)度的減弱程度越為明顯，由此可知，PAA對(duì)淀粉酶有熒光猝滅作用，分析原因可能是Trp殘基所處微環(huán)境的極性增大，使Trp殘基在溶劑環(huán)境中暴露程度降低[12]。此外，隨著PVA或PAA濃度的增加，最大吸收波長(zhǎng)(λmax)均發(fā)生紅移，由最大波長(zhǎng)337 nm紅移至340 nm，說(shuō)明PVA或PAA的作用使得α-淀粉酶部分肽鍵間疏水作用減弱，肽鍵羰基n→π*躍遷能量減少，肽鍵伸展[7]。由此可見，PVA或PAA的存在會(huì)使得α-淀粉酶分子中色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，使α-淀粉酶活性降低。

2.3 PVA/PAA對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

酶活性變化通常伴隨著酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和活性構(gòu)象的改變。圓二色譜(CD光譜)是分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的工具[13-15]，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)到二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化信息。PVA、PAA對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如圖5和圖6所示。從圖5和圖6可以看出，PVA或PAA的存在，改變了α-淀粉酶的次級(jí)結(jié)構(gòu)組成，具體體現(xiàn)在α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的質(zhì)量組成均發(fā)生變化，且隨著PVA或PAA濃度的增加，α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的質(zhì)量組成的變化越明顯。

圖5 PVA濃度對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖6 PAA濃度對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

一個(gè)由8個(gè)α-螺旋和8個(gè)β-折疊交替出現(xiàn)形成的(β/α)8桶形結(jié)構(gòu)組成了α-淀粉酶的催化區(qū)域(CD)，由此可知，α-淀粉酶是α/β結(jié)構(gòu)模體的酶。酶的天然構(gòu)象以及酶的特定功能域?qū)γ傅幕钚员３质种匾?，而酶的特定功能域的形成以及酶的?gòu)象的變化又與適當(dāng)?shù)摩?螺旋含量和一定的α/β比率密切相關(guān)[15]。圖5中α-淀粉酶的α-螺旋的含量會(huì)隨著PVA含量的增加而逐漸減小，而當(dāng)α-螺旋度的構(gòu)象過(guò)小時(shí)，可能會(huì)使酶蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)和其他結(jié)構(gòu)遭到破壞而產(chǎn)生酶結(jié)構(gòu)不可逆的變化。圖6中隨著PAA含量的增加，α-螺旋的含量也在逐漸增大，由于α-螺旋結(jié)構(gòu)緊密的特殊性，酶的構(gòu)象中α-螺旋過(guò)大，則不利于酶形成活性中心，從而使底物不能與之結(jié)合，使酶活性喪失[16]。此外，α-淀粉酶的天然構(gòu)象與α/β的比率也密切相關(guān)，特定的α/β 比率決定天然構(gòu)象。圖7、圖8分別表示了PVA和PAA對(duì)α-淀粉酶α-螺旋/β-折疊比率的影響。

圖7 PVA含量對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋/β-折疊比率的影響

圖8 PAA含量對(duì)α-淀粉酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋/β-折疊比率的影響

結(jié)合圖1、圖2可知，PVA或PAA的濃度越大，α-淀粉酶的相對(duì)酶活越低，α-螺旋/β-折疊比率變化越大。酶分子的折疊或去折疊會(huì)隨著α/β的比率變化而變化，α/β的比率變化越大，折疊或去折疊的變化就會(huì)越大，總體上就會(huì)呈現(xiàn)出越多的錯(cuò)誤折疊，最終不能形成酶的天然構(gòu)象，從而使酶失去應(yīng)有的活性，即酶的天然構(gòu)象改變?cè)蕉啵钚灾行幕蚴擎I合位點(diǎn)就越少，酶的活性就越低[16]。

3 結(jié)論

PVA和PAA均能使α-淀粉酶的活性降低，并能改變?chǔ)?淀粉酶的內(nèi)源性熒光和二級(jí)結(jié)構(gòu)，且PVA和PAA的濃度越高，酶活性越低，酶的內(nèi)源性熒光和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化越大。

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