李 軍， 龔一富， 胡朝陽， 王何瑜

(寧波大學海洋學院 教育部應用海洋生物技術重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

花青素，作為一種重要的植物類黃酮類色素，是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，對植物自身生理活動具有許多重要的生物學功能，如賦予植物、花卉及水果紫色、紅色及藍色等鮮艷的顏色，吸引昆蟲幫助植物傳播花粉，保護植物免受紫外線的傷害[1]以及抵御病源微生物的入侵[2]。紫色土豆花青素具有很強的抗氧化性[3]，具有清除氧自由基[4]、抗炎和抗癌[5]等作用，目前已作為一種天然保健品而廣受關注。類黃酮3′,5′-羥化酶(flavonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H)作為細胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP)家族的成員[6]，是花青素生物合成途徑中的一個關鍵酶， 紫色土豆中F3′5′H基因的克隆及分析研究將對揭示F3′5′H蛋白在紫色土豆花青素合成中的作用具有重要理論意義，可為開展紫色土豆花青素代謝工程奠定理論基礎。目前，已從茄子(Daturastramonium)[7]、矮牽牛(Pctuniahybrida)[8-9]、洋桔梗(Eustomagrandiflorum)[10]、番茄(Solanumlycopersicum)[11]、箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.)[12]、非洲紫羅蘭(SaintpauliaionanthaH.Wendl.)[13]、野生大豆(Glycinesoja)[14]、山葡萄(VitisamurensisRupr)[15]等植物中克隆了F3′5′H基因序列。目前NCBI網(wǎng)站上已公布至少38種植物約58條F3′5′H基因序列[16]。許多研究表明，花青素生物合成受到外界因素的調(diào)控，如干旱、低溫、強光、低氮、蕓苔素、赤霉素、蔗糖等[17-21]。但目前紫色土豆花青素合成途徑中的F3′5′H基因的分離及鑒定研究國內(nèi)外未見報道，且目前關于植物花青素生物合成的相關基因表達、信號轉導及調(diào)控的研究主要集中在花上，但對于塊莖等其他部位的花青素積累鮮有報道。紫色土豆生長在地下，紫色土豆花青素的合成和積累的調(diào)控研究將填補地下花青素積累機制的空白，對探明地下部分花青素積累的分子機制研究提供基礎和參考，因此，本研究擬克隆紫色土豆StF3′5′H基因序列，并研究赤霉素和蔗糖等因子對紫色土豆花青素含量的影響，并通過測定StF3′5′H基因表達來探討花青素積累的機理，為下一步更全面更深入開展地下部分花青素積累的分子機制提供參考。

1材料與方法

1.1 紫色土豆F3′5′H基因cDNA序列的克隆

本研究所用紫色土豆試管苗由寧波大學海洋學院植物組織培養(yǎng)實驗室培養(yǎng)并保存。紫色土豆總RNA提取采用BIOZOL法(BioFlux，日本)，cDNA第一鏈的合成采用AMV反轉錄酶(TaKaRa，日本)，合成的第一鏈cDNA混合物作為擴增紫色土豆F3′5′H基因核心序列的模板。分析其他植物F3′5′H基因核苷酸序列，設計一對簡并引物StF3′5′H-F和StF3′5′H-R (表1)，用于StF3′5′H核心序列的擴增。

根據(jù)測序結果，分別設計擴增5′-UTR和3′-UTR的引物：StF3′5′H 5-1 和StF3′5′H 5-2 以及StF3′5′H 3-1 和StF3′5′H 3-2 (表1)，按照RACE試劑盒 (Clontech, USA)說明書進行5′-RACE和3′-RACE擴增。PCR擴增測序后用Vector NTI Suite 8.0軟件拼接出StF3′5′H基因的cDNA全長序列。用StF3′5′H-F (表1)和oligo(dT)17為引物，使用one-step RT-PCR Kit (TaKaRa, 日本) 進行cDNA全長克隆，驗證已獲得的序列。

表1 StF3′5′H基因的引物序列

1.2 StF3′5′H基因的生物信息學分析

應用Vector NTI Suite 8.0軟件的ASSEMBLE程序拼接紫色土豆F3′5′H基因的核心片段序列、5′末端序列和3′末端序列，得到紫色土豆F3′5′H基因的cDNA全長序列；利用ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)程序預測StF3′5′H蛋白的理論等電點和分子量。利用Vector NTI Suite 8.0軟件包中的Align X程序?qū)ψ仙炼笷3′5′H蛋白序列與其它植物的F3′5′H蛋白序列進行多重序列比對；使用Clustal X軟件和MEGA 5.0中的Neighbor-Joining(臨位相連法)構建紫色土豆F3′5′H蛋白和其它植物F3′5′H蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生進化樹。

1.3 StF3′5′H基因組成型表達分析

分別提取紫色土豆塊莖、根、莖、葉柄、葉軸和葉片的RNA，以及蔗糖和赤霉素處理24 h后的紫色土豆試管苗RNA。設計一對特異性引物StF3′5′H-F1和StF3′5′H-R1，選用actin為內(nèi)參，引物序列為actinF 和 actinR (表1)，按one-step RT-PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，擴增循環(huán)數(shù)為28個。PCR產(chǎn)物于用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，然后密度掃描分析產(chǎn)物條帶。

1.4 不同濃度蔗糖和赤霉素對紫色土豆花青素含量的影響

將長勢健壯且大小基本相同的試管小苗分別移栽到添加有不同濃度蔗糖或赤霉素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，蔗糖濃度設置5個梯度，分別是0 g/L、15 g/L、30 g/L、60 g/L和120 g/L。赤霉素設置5個梯度，其濃度分別是0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和4.0 mg/L，培養(yǎng)30 d后剪取紫色土豆試管苗，測定其花青素含量?；ㄇ嗨睾繙y定方法為：精確稱取0.1 g紫色土豆試管苗，加石英砂充分研磨后加入10 mL含0.1% HCl的酸性乙醇，在28℃提取18 h，然后10 000 r/min離心10 min，吸取上清，用可見光分光光度計分別測定530 nm和657 nm下樣品的吸光值A530和A657，花青素含量計算公式為：Q=A530-0.25A657(mg/g·FW)[22]。

2 結果與分析

2.1StF3′5′H基因cDNA全長序列

采用RACE技術擴增得到StF3′5′H基因核心片段、5′末端序列和3′末端序列，拼接得到StF3′5′H基因的cDNA全長為1854 bp(圖1)。ORF分析表明，StF3′5′H基因ORF長為1530 bp，ORF兩端分別含有239 bp 3′UTR和85 bp 5′UTR，共編碼509個氨基酸，預測編碼產(chǎn)物分子量大小為56.95 kD，等電點(pI)為8.31。

2.2StF3′5′H基因生物信息學分析

使用BlastP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 以及Vector NTI Suite 8.0 軟件對StF3′5′H cDNA核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)進行相似性分析，結果表明，紫色土豆F3′5′H的cDNA序列與其它種土豆(AY675558.1和AY675561.1)、番茄(AK328022.1)、藍花茄(AF313490.1)和茄子(X70824.1))的相似度分別為97%、94%、90%和89%。紫色土豆F3′5′H蛋白的氨基酸序列與其它被子植物的F3′5′H蛋白具有較高的相似性，與番茄(Solanumlycopersicum)、瓜葉菊(Pericalliscruenta)、長春花(Catharanthusroseus)、葡萄(Vitisvinifera)和仙客來(Cyclamenpersicum)的氨基酸相似性分別為94%、86%、76%、75%和75%，表明所克隆的序列為植物F3′5′H家族成員。同源性分析顯示(圖2)，紫色土豆F3′5′H蛋白與其它物種中F3′5′H蛋白的保守結構域基本保持一致，這些氨基酸的序列差異主要體現(xiàn)在N端，其中部和C端序列高度保守。

使用Clustal X軟件和MEGA5.0軟件分析植物F3′5′H蛋白的系統(tǒng)進化(圖3)。結果表明，紫色土豆F3′5′H蛋白與其它品種土豆、山葡萄、葡萄及仙客來的F3′5′H蛋白親緣關系較近，聚為一類。

2.3 StF3′5′H基因組織表達差異性

圖1 土豆StF3′5′H的核苷酸序列及推導的氨基酸序列

Fig 1 cDNA sequence and predicted amino acid sequence of StF3′5′H

加粗、下劃線表示起始密碼子(ATG)；加粗、斜體表示終止密碼子(TGA)；陰影部分表示poly (A)尾巴；雙下劃線表示預測的poly (A)尾巴加尾信號。

圖2 紫色土豆F3′5′H與其它F3′5′H的氨基酸序列比對Fig 2 Alignment of deduced amino acid sequences of StF3′5′H with other F3′5′H proteinsMotifs are boxed；StF3′5′H: 紫色土豆 Purple Solanum tuberosum; StLF3′5′H: 土豆Solanum tuberosum L; GmF3′5′H: 大豆Glycine max; GhF3′5′H: 陸地錦Gossypium hirsutum; PcF3′5′H: 瓜葉菊Pericallis cruenta; DkF3′5′H: 柿子Diospyros kaki; PtF3′5′H: 毛果楊populus trichocarpa; CsF3′5′H: 茶樹Camellia sinensis; DgF3′5′H: 大花飛燕Delphinium grandiflorum; VhF3′5′H: 美女櫻Verbena hybrida; EgF3′5′H: 洋桔梗Eustoma grandiflorum; SlF3′5′H: 番茄Solanum lycopersicum; CrF3′5′H: 長春花Catharanthus roseus; VmF3′5′H: 蔓長春花Vinaca major Linn; VvF3′5′H: 葡萄Vitis vinifera; GsF3′5′H: 野生大豆Glycine soja; CpF3′5′H: 仙客來Cyclamen persicum.

圖3 F3′5′H蛋白家族系統(tǒng)進化樹

Fig 3 Molecular phylogenetic tree of the deduced amino
acid sequences of F3′5′H family members

圖4 紫色土豆F3′5′H基因組織表達分析

采用半定量RT-PCR技術分析StF3′5′H基因在紫色土豆不同組織中(塊莖、根、莖、葉柄、葉軸和葉片)的表達情況。結果表明(圖4)，StF3′5′H基因在不同組織中表達存在差異性，StF3′5′H基因在根、莖和葉柄中表達量較高，其中葉柄表達量最高，根次之，莖最低。而StF3′5′H基因在塊莖、葉軸和葉片中幾乎檢測不到。

2.4 赤霉素和蔗糖對紫色土豆花青素積累和StF3′5′H基因表達的影響

研究不同濃度赤霉素對紫色土豆花青素積累和StF3′5′H基因表達的影響，結果表明(圖5A)，隨著赤霉素濃度的增加，紫色土豆花青素含量呈先上升后下降的趨勢，赤霉素處理組花青素含量均顯著高于未處理對照組，說明赤霉素能促進紫色土豆花青素的積累。當赤霉素濃度為1.0 mg/L時，紫色土豆花青素含量達到最大值，為2.90 mg/g·FW，約為未處理對照組的2.4倍。StF3′5′H基因表達分析表明(圖5A)，不同濃度赤霉素處理組StF3′5′H基因表達量均顯著高于未處理組，表明赤霉素能誘導StF3′5′H基因表達，但不同濃度赤霉素處理組間StF3′5′H基因表達量差異不顯著，與花青素含量不成正相關。

研究不同濃度蔗糖對紫色土豆花青素積累和StF3′5′H基因表達的影響，結果表明(圖5B)，隨著蔗糖濃度的增加，紫色土豆花青素含量呈逐漸上升的趨勢，蔗糖處理組花青素含量均顯著高于未處理對照組，說明蔗糖能顯著促進紫色土豆花青素的積累。當蔗糖濃度為120 g/L時，紫色土豆花青素含量達到最大值，為4.8 mg/g·FW，約為未處理對照組花青素含量的7.1倍。StF3′5′H基因表達分析表明(圖5B)，不同濃度蔗糖處理組StF3′5′H基因表達量均顯著高于未處理組，表明蔗糖能顯著誘導StF3′5′H基因的表達，當蔗糖濃度為120 g/L時，StF3′5′H基因表達量最高。比較不同濃度蔗糖處理條件下紫色土豆StF3′5′H基因表達量和花青素含量之間的相關性，結果表明，StF3′5′H基因表達量越高，花青素含量就越高，StF3′5′H基因表達越低，花青素含量也較低，StF3′5′H基因表達量與花青素積累之間呈正相關，表明StF3′5′H基因是紫色土豆花青素生物合成途徑中的關鍵酶。

圖5 誘導劑(GA3和蔗糖)誘導(24 h)下的StF3′5′H基因表達和花青素積累Fig 5 Expression profiles of StF3′5′H and anthocyanin accumulation after induced by elicitors (GA3 and sucrose)

A—不同濃度赤霉素處理24 h后StF3′5′H的表達及花青素的積累；B—不同濃度蔗糖處理24 h后StF3′5′H的表達及花青素的積累。

3討論

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)赤霉素對植物的生長發(fā)育(如種子的萌發(fā)、莖的伸長、花的發(fā)育等)以及花青素的積累具有重要調(diào)節(jié)作用[23]。赤霉素是否對花青素積累具有促進作用，前人有兩種截然不同的觀點，有的研究表明赤霉素促進花青素的積累，而部分研究者的結果表明赤霉素抑制花青素的生物合成。前人研究表明，赤霉素對非洲菊[24]、玫瑰花[25]、長春花[26]、蓮霧[27]等花器官中花青素的積累具有促進作用，而赤霉素對草莓果實[28]、玉米葉片[29]和低光照下生長的擬南芥[30]等非花器官中花青素的積累具有抑制作用。本研究結果表明，赤霉素能顯著促進紫色土豆非花器官花青素的積累，與前人在花器官中得出的結論一致，但與非花器官中得出的結論相反，說明赤霉素對紫色土豆與草莓、玉米等植物花青素積累的機制可能不一樣。

蔗糖不僅可以作為植物生長發(fā)育的能源物質(zhì)，同時還可以作為信號傳導物質(zhì)，在植物生命周期的各個階段起到初級信使的作用[31-33]。前人研究表明，蔗糖能誘導花青素生物合成途徑中相關基因的表達，并促進植物花青素的積累，如蔗糖促進了矮牽牛[34]、擬南芥等[35]花青素含量的積累及其合成基因的表達。本研究表明，蔗糖能顯著促進紫色土豆花青素生物合成基因的表達及其含量的積累，且花青素積累與合成基因表達呈正相關，這與前人研究結論一致，說明赤霉素是通過誘導花青素生物合成基因的表達來促進花青素的積累的。蔗糖是如何通過調(diào)控花青素生物合成基因表達，或者是否調(diào)控其它途徑，如離子通道、ROS等，目前還不清楚。蔗糖調(diào)控花青素積累涉及到復雜的代謝網(wǎng)絡，為了更好地理解和弄清楚蔗糖調(diào)控花青素生物合成的分子機制，可以采用轉錄組學、蛋白組學和代謝組學技術進一步探究花青素生物合成調(diào)控分子機制。

4 結論

從紫色土豆中克隆得到花青素合成關鍵基因F3′5′H，該基因的cDNA全長1854 bp,包含1530 bp ORF、編碼509個氨基酸。該基因推測編碼的氨基酸與其它植物的F3′5′H蛋白相似性很高。半定量RT-PCR分析表明StF3′5′H基因在不同組織中的表達具有差異性，結果表明該基因在根、莖和葉柄中的表達量較高，其中在葉柄中表達最強，而在塊莖、葉軸中和葉片中幾乎檢測不到StF3′5′H基因的表達。赤霉素和蔗糖都能促進StF3′5′H的表達進而促進花青素的積累，但赤霉素的促進作用在不同濃度組之間差別不大，而蔗糖的促進作用則隨著其濃度的增加而不斷增加，StF3′5′H基因表達量和花青素含量都不斷增加。說明該基因可能參與調(diào)控紫色土豆中花青素的合成。

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