董玉穩(wěn)， 湯 斌， 李 松， 張瑩瑩， 李祥林

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，蕪湖 241000)

纖維素酶是一類能將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用來分解纖維素成寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[1]?？蓮V泛應(yīng)用于能源、食品、飼料、造紙、洗滌、紡織、印染、釀酒等多個(gè)行業(yè)[2]。纖維素酶系是一個(gè)復(fù)雜的酶系，主要由3類不同功能的酶組成：內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(纖維二糖水解酶，CBH)和β-葡萄糖苷酶(纖維二糖酶，BG)。內(nèi)切葡聚糖酶可隨機(jī)水解β-1, 4糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素截?cái)?，生成不同長(zhǎng)度的纖維素短鏈，為外切葡聚糖酶提供反應(yīng)末端；外切葡聚糖酶可作用于纖維素鏈的末端，依次從纖維素鏈上切下纖維二糖；β-葡萄糖苷酶主要將纖維二糖水解成葡萄糖，也可以從可溶性纖維寡糖的非還原端切下葡萄糖[3]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)同的一種絲狀真菌對(duì)纖維素降解模型是：真菌能夠分泌少量組成型纖維素酶至胞外，這些組成型纖維素酶能將纖維素底物水解成低分子量糖類，這些可溶性的低分子量糖類可以進(jìn)入胞內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)更多纖維素酶基因的表達(dá)[4]。目前對(duì)組成酶的研究還較少，研究者們主要是對(duì)木酶[5]，青霉[6]研究，他們只是在2%葡萄糖的培養(yǎng)基中檢測(cè)到纖維素酶活，或者對(duì)阻遏培養(yǎng)基中的調(diào)控因子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)纖維素酶基因的啟動(dòng)子上存在抑制因子(ACE1、CER)等，對(duì)組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶基因的克隆研究還鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)的匍枝根霉是一株具有較高纖維素酶分泌的絲狀真菌，目前已從匍枝根霉中克隆出3個(gè)內(nèi)切纖維素酶基因，2個(gè)β-葡萄糖苷酶基因，并進(jìn)行了原核和真核表達(dá)，對(duì)內(nèi)切葡聚糖苷酶基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子生物學(xué)分析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行初步研究。和大多真菌一樣匍枝根霉的纖維素酶的合成受到葡萄糖的抑制，在以2%葡萄糖為唯一碳源時(shí)所產(chǎn)的纖維素酶定義為組成型纖維素酶[7]。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)匍枝根霉組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶基因進(jìn)行了篩選、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究，有助于我們了解組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶的相關(guān)性質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌種和試劑

匍枝根霉TP-02(由安徽工程大學(xué)可再生資源實(shí)驗(yàn)室保存)；大腸桿菌BL21(DE3)，質(zhì)粒pET22；TaqDNA聚合酶，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，PCR試劑，mRNA提取試劑盒，AMV cDNA第一鏈合成試劑盒均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。SDS-PAGE所用試劑均為分析純；SDS-PAGE所需儲(chǔ)備液及緩沖液[8]；SDS洗脫液：10 mM Tris (pH值7.5)，5 mM巰基乙醇，20%異丙醇；蛋白復(fù)性液：50 mM醋酸鈉(pH值4.8)，5 mM巰基乙醇，1 mMEDTA；0.1%的剛果紅染色液：稱取0.1 g剛果紅溶解于100 mL重蒸水混勻后于室溫保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

組成酶培養(yǎng)基：葡萄糖 2%，硫酸銨 0.3%，硫酸鎂 0.1%，磷酸二氫鉀 0.1%，氯化鈣 0.2%，吐溫-80 0.025%，微量元素液。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化鈉 1%，pH值7.0。

陽性克隆篩選培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化鈉 1%，CMC-Na 1%，瓊脂粉 2%，pH值7.0。

重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 1%，蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化鈉 1%，pH值7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活的測(cè)量

匍枝根霉組成型內(nèi)切酶酶活的測(cè)量：把匍枝根霉種子液接種于組成酶培養(yǎng)基，在180 r/min，30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔6 h取樣進(jìn)行酶活分析。

重組菌內(nèi)切酶酶活的測(cè)量：將篩選的陽性克隆于37℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔4 h取樣測(cè)定內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活。

還原糖測(cè)定方法：DNS法測(cè)還原糖[9]。

酶活力測(cè)定方法：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入l mL l%(w/v)的CMC-Na溶液(溶于pH值4.8的0.l mol/L HAc-NaAc緩沖液中)，50℃反應(yīng)30 min后加入3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后加水稀釋到25 mL，在520 nm測(cè)OD值。

酶活定義：每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)活力單位(IU)。

1.2.2 匍枝根霉組成型cDNA文庫的構(gòu)建[10]

匍枝根霉在組成型培養(yǎng)基中發(fā)酵到30 h后離心得到菌絲體，采用Trizol裂解法來提取總RNA，mRNA的分離、cDNA精制及雙鏈合成采用試劑盒法。將獲得的雙鏈DNA與含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的接頭相連接，使用EcoRⅠ和NotⅠ酶對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。并與同樣雙酶切的質(zhì)粒pET22相連接，將上述連接產(chǎn)物用CaCl2方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得匍枝根霉組成型cDNA文庫

1.2.3 匍枝根霉組成型cDNA文庫的篩選

把重組菌涂布于含有抗性的LB平板上于37℃下靜置培養(yǎng)24 h，后用剛果紅染色，具有透明圈的克隆子即為所需的陽性克隆。

1.2.4 測(cè)序及序列分析

基因測(cè)序：委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；序列分析結(jié)合EditSeq及ProtParam軟件預(yù)測(cè)；家族歸屬對(duì)比保守序列數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活，計(jì)算相對(duì)酶活，研究溫度對(duì)內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活的影響。

分別在pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0條件下測(cè)定酶活，計(jì)算相對(duì)酶活，研究pH值對(duì)內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活的影響。

1.2.6 重組菌所分泌內(nèi)切葡聚糖苷酶分子量大小的測(cè)定[6]

配制含0.1%CMC-Na的12%分離膠，粗酶液與上樣緩沖液按比例混合后于75℃水浴10 min，離心后上樣。待電泳結(jié)束后取出分離膠，先用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，顯出mark和發(fā)酵所產(chǎn)蛋白。在用SDS洗脫液洗脫2次，每次1 h。然后將膠用pH值4.8的HAc-NaAc緩沖液洗脫后放入復(fù)性液，4℃搖晃過夜，使蛋白復(fù)性。將復(fù)性后的凝膠浸泡于pH值4.8的HAc-NaAc緩沖液，在50℃反應(yīng)1 h，使膠中復(fù)性后的內(nèi)切酶和膠中的CMC-Na反應(yīng)。用純凈水沖洗后，用0.1%的剛果紅染色約20～30 min，然后用l mol/L的氯化鈉溶液脫色至看出水解圈，最后用5%的醋酸沖洗終止反應(yīng)[11]。透明圈即為重組菌分泌的內(nèi)切葡聚糖苷酶在SDS-PAGE電泳膠上的位置，比照蛋白質(zhì)Mark，測(cè)算出重組內(nèi)切葡聚糖苷酶分子量大小。

2結(jié)果與討論

2.1 匍枝根霉組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活的時(shí)間曲線

匍枝根霉的組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶分泌在30 h達(dá)到最大為0.92 IU/mL，如圖1所示。這和誘導(dǎo)條件下的匍枝根霉所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶有較大差別[12]，匍枝根霉在誘導(dǎo)條件下在84 h達(dá)到最大酶活。根據(jù)匍枝根霉有的組成型內(nèi)切酶的分泌特性，推斷匍枝根霉具有組成型內(nèi)切酶的分泌能力，為組成型cDNA文庫的構(gòu)建提供前提。

圖1匍枝根霉組成型CMC酶活曲線

Fig 1 Activity of endoglucanse byRhizopusstoloniferconstitutive

圖2總RNA的提取

Fig 2 Total RNA ofRhizopusstolonifer

2.2 組成型cDNA文庫的構(gòu)建

匍枝根霉在組成型培養(yǎng)基中發(fā)酵到30 h后離心得到菌絲體，采用Trizol裂解法來提取總RNA，如圖2所示，可以用于mRNA的純化，純化后確保了無基因組DNA的污染，也保證了組成型文庫的質(zhì)量。cDNA精制和雙鏈合成采用試劑盒法。將獲得的雙鏈DNA與含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的接頭相連接，使用EcoRⅠ和NotⅠ酶對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。并與同樣雙酶切的質(zhì)粒pET22相連接，將上述連接產(chǎn)物用CaCl2方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得匍枝根霉組成型cDNA文庫。

2.3 重組菌的篩選

將cDNA文庫重組子涂布于含CMC的LB平板上，待形成單菌落后，用1%剛果紅溶液染色1 h，后用5%的 醋酸溶液進(jìn)行脫色固定染色圈，被內(nèi)切葡聚糖苷酶分解后的羧甲基纖維素鈉能和剛果紅發(fā)生反應(yīng)，到能夠利用羧甲基纖維素鈉的重組菌周圍有透明圈，從而可以很便捷地篩選到陽性克隆。圖4為重組zeg1和zeg2菌落，周圍有透明圈。

圖3 cDNA精制

Fig 3 Purification of cDNA

圖4重組zeg1和zeg2篩選

Fig 4 The result of positive clone screening

圖5 重組zeg1和zeg2的CMC酶活曲線

2.4 測(cè)序及序列分析

將陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，獲得2個(gè)不同基因序列zeg1和zeg2，zeg1大小為1164 bp，zeg2大小為1251 bp。結(jié)合EditSeq軟件及ProtParam的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示zeg1基因共編碼387個(gè)氨基酸，具體序列如下：MSSSSRNSTSLTAPATTRSSPAPPTSRPSGRTSPGSSRTTTWSSSTRVSTPLPPAVRTNTTTDNEYNTMDQTLVLDLNQAAIDGIRAAGATSQYIFAEGNSWSGAWTWADINDNMKALTDPQDKLVYEMHQYLDSDGSGTSGVCVSETIGAERLQAATQWLKDNGKVGILGEYAGGANDVCRTAIAGMLEYMGNNTDVWKGAVCGRLAPVADYMFSMSGPAAAYSGCWTCWRRIWVTAQFFILLLRGLVESEWRRIRSEGPLSYNIQEVGRRIRVRHSGNLSAFTPHDKIPPVDWARVSTTSSRIPPPSRLSSARAGTSSACSSCWKDWSRTRCRGRMTRPTCTISRRLVRASTPSWSRLIRSGGECNHGCRCPCHCRPSYYGRSCV

zeg1的分子式為C1814H2858N556O567S24，相對(duì)分子量為42.3 kD，理論等電點(diǎn)為9.42，屬于堿性蛋白質(zhì)，推測(cè)半衰期大于10 h。親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.459，結(jié)合ProtScale的分析結(jié)果，推斷zeg1為可溶性蛋白。

結(jié)合EditSeq軟件及ProtParam的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示zeg2基因共編碼416個(gè)氨基酸，具體序列如下：MSSSSRNSTSLTAPATTRSSPAPPTSRPSGRTSPGSSRTTTWSSSTRVSTPLPPAVRTNTTTDNEYNTMDQTLVLDLNQAAIDGIRAAGATSQYIFAEGNSWSGAWTWADINDNMKALTDPQDKLVYEMHQYLDSDGSGTSGVCVSETIGAERLQAATQWLKDNGKVGILGEYAGGANDVCRTAIAGMLEYMANNTDVWKGAVWWAAGPWWADYMFSMEPPSGPAYSGMLDVLAPYLGSAAAFLSSSNGRPPRHSSPLVARIFQRFRNSWLLFSNVCCPHPRYPQLMSAHNDRDRIQSVGRRVRHRHSGNLGAFTPHDKIPPVDWARVSTTSSRIPPPSRLSSARASTSSACSSSWKDWSRTRYRGRMPRPTCPISRRYVRASTPCCSRLISSGGDCNHGCRCPCHRTPSYLCTIV

zeg2的分子式為C1959H3046N594O607S24，相對(duì)分子量為45.4 kD，理論等電點(diǎn)為9.44，屬于堿性蛋白質(zhì)推測(cè)半衰期大于10 h。親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.505，結(jié)合ProtScale的分析結(jié)果，推斷zeg2為可溶性蛋白。

經(jīng)比對(duì)zeg1和zeg2有86%的相似性，有相似的催化活性區(qū)域。經(jīng)CDD(保守序列數(shù)據(jù)庫)分析，該蛋白歸屬于糖苷水解酶第5家族，對(duì)比PDB(蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫)中第五家族的關(guān)鍵催化殘基，預(yù)測(cè)該兩個(gè)蛋白的第147位的谷氨酸(E)及199位的色氨酸(W)為該蛋白的催化殘基，如圖6。

圖6 zeg1和zeg2蛋白關(guān)鍵催化殘基示意圖

圖7重組菌的CMC酶最適作用溫度

Fig 7 The optimum temperature of recombinant strains

圖8重組菌的CMC酶最適作用pH值

Fig 8 The optimum pH of recombinant strains

2.5 重組菌內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活測(cè)定

將可編碼zeg1和zeg2大腸桿菌BL21(DE3)于37℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔4 h取樣測(cè)定內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活。重組菌發(fā)酵曲線如圖5所示 zeg1在重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵20 h達(dá)到最大酶活0.422 IU/mL；zeg2在重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h達(dá)到最大酶活0.509 IU/mL。

2.6 重組菌粗酶酶學(xué)性質(zhì)研究

圖6和圖7所示，zeg1和zeg2的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值都是5.0。這和其他內(nèi)切酶重組菌所分泌的內(nèi)切酶的最適溫度和最適pH值相似[13-14]。

2.7 對(duì)重組菌所分泌內(nèi)切葡聚糖苷酶分子量大小的測(cè)定

先對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，顯出蛋白質(zhì)條帶和mark，洗脫凝膠后復(fù)性，使得凝膠中的內(nèi)切葡聚糖苷酶與膠中的CMC-Na反應(yīng)，用剛果紅染色后出現(xiàn)透明圈如圖所示，泳道1為重組菌zeg1的發(fā)酵液電泳圖；泳道2為重組菌zeg2的發(fā)酵液電泳圖，對(duì)比旁邊M泳道的蛋白質(zhì)mark，測(cè)算出zeg1和zeg2重組菌所分泌蛋白的分子量分別為55 kD、58 kD。

圖9 重組zeg1和zeg2 CMC-SDS-PAGE電泳

泳道M為蛋白質(zhì)mark：分子量從下到上為98、66.2、45、31、20、14.4 kD；泳道1為重組zeg1的發(fā)酵液電泳圖：泳道2為重組zeg2的發(fā)酵液電泳圖。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)從匍枝根霉在組成型培養(yǎng)基中檢測(cè)到內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活為線索，構(gòu)建了組成型cDNA文庫，成功分離出兩株匍枝根霉組成型葡聚糖苷酶基因zeg1和zeg2；經(jīng)比對(duì)zeg1和zeg2有86%的相似性，有相似的催化活性區(qū)域。經(jīng)CDD(保守序列數(shù)據(jù)庫)分析，該蛋白歸屬于糖苷水解酶第5家族，對(duì)比PDB(蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫)中第五家族的關(guān)鍵催化殘基，預(yù)測(cè)該兩個(gè)蛋白的第147位的谷氨酸(E)及199位的色氨酸(W)為該蛋白的催化殘基；通過對(duì)最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH值的探究發(fā)現(xiàn)和誘導(dǎo)型內(nèi)切葡聚糖苷基因的重組菌分泌的內(nèi)切酶相似[13]；通過CMC-SDS-PAGE電泳較準(zhǔn)確的測(cè)算出重組zeg1和zeg2所分泌蛋白的分子量分別為55 kD、58 kD。

匍枝根霉分泌的組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶在30 h達(dá)到最大，而匍枝根霉在誘導(dǎo)條件下內(nèi)切葡聚糖苷酶在84 h達(dá)到最大，組成和誘導(dǎo)型內(nèi)切葡聚糖苷酶在分泌時(shí)間上有很大差異，組成型酶的分泌明顯提前，這和前言中闡述的纖維素降解模型相一致。

本文雖對(duì)組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶基因的成功篩選和表達(dá)，但是酶活較低，這可能和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)自身的缺陷有關(guān)，比如說缺乏使真核生物蛋白質(zhì)復(fù)性的功能，缺乏修飾真核生物蛋白質(zhì)的功能，其次內(nèi)源性蛋白酶會(huì)降解一些異源蛋白等。

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