李亞鵬, 陳明杰, 趙妍, 汪虹

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306; 2. 國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403)

在受到低溫脅迫時(shí)，生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)易受到損傷，流動(dòng)性降低，對(duì)物質(zhì)的主動(dòng)吸收和運(yùn)輸功能下降，導(dǎo)致胞內(nèi)溶質(zhì)外滲，影響細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定性[1]。通常生物細(xì)胞通過促進(jìn)相容性溶質(zhì)的積累來維持細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定，保證各種生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[2]。這些相容性溶質(zhì)主要包括K+、Na+等無機(jī)離子，以及胞內(nèi)合成的有機(jī)溶質(zhì)，如可溶性糖與糖醇(海藻糖、蔗糖、甘露醇等)、氨基酸及其衍生物(脯氨酸、甜菜堿等)[3-4]。

海藻糖是廣泛存在于真菌中穩(wěn)定的天然雙糖[5]。真菌中的海藻糖被認(rèn)為既可作為貯藏性碳源，在孢子萌發(fā)或子實(shí)體發(fā)育階段被分解為葡萄糖提供能量，又可在極端溫度、輻射、脫水等脅迫環(huán)境下作為有效的細(xì)胞保護(hù)劑[6]。目前海藻糖在食用菌抵御低溫逆境方面的作用研究很少，但在對(duì)酵母的研究中發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)海藻糖水平較高的酵母菌株往往對(duì)由逆境引起的高滲脅迫具有較高的耐受性[7-8]。如抗凍面包酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株FRI413細(xì)胞中海藻糖的含量是普通面包酵母菌株的2倍，且實(shí)驗(yàn)證明酵母在發(fā)酵過程中體內(nèi)積累海藻糖的量與其耐冷凍性緊密相關(guān)[9]。海藻糖在不同物種中存在多條代謝途徑，其合成與分解均可被調(diào)控，并受到外在脅迫的啟動(dòng)與誘導(dǎo)。在有隔擔(dān)子菌亞綱傘菌目與非褶菌目的菌絲體和子實(shí)體中均存在一種α型的海藻糖磷酸化酶(trehalose phosphorylase；EC 2.4.1.64；TP)，能夠可逆地催化海藻糖的合成與分解[10-11]。真菌海藻糖磷酸化酶被分類在糖基轉(zhuǎn)移酶家族的4號(hào)家族，與蔗糖磷酸化酶有顯著區(qū)別[12]。該酶最早在EuglenagracilisKlebs中被報(bào)道[13]，在裂褶菌(Schizophyllumcommune)、雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)等真菌中均有發(fā)現(xiàn)[14]。

草菇[Volvariellavolvacea(Bull.) Singer]是一種原產(chǎn)于中國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)的食用菌，隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、光柄菇科、小包腳菇屬，其菌絲的最適生長(zhǎng)溫度為32～35℃，子實(shí)體分化發(fā)育的適宜溫度是27～31℃[15]。由于草菇屬高溫菇種，其菌絲或子實(shí)體在常規(guī)0～4℃的冷藏條件下不耐貯藏，出現(xiàn)變軟、液化等低溫自溶現(xiàn)象[16]。草菇這種不耐低溫的特性，影響了菌種的低溫保藏、子實(shí)體的采收后貯藏與運(yùn)輸，嚴(yán)重阻礙了草菇產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。本課題組在草菇全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，完成了草菇低溫表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因涉及碳水化合物代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)合成降解以及核苷酸代謝等多條代謝途徑。本實(shí)驗(yàn)選取涉及海藻糖合成降解途徑中的海藻糖磷酸化酶基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了低溫處理不同時(shí)間的草菇菌絲體中該酶的基因表達(dá)量變化，初步推測(cè)海藻糖磷酸化酶基因與草菇耐低溫特性間的相關(guān)性，以期為揭示草菇低溫自溶的遺傳機(jī)制以及今后對(duì)草菇的耐冷特性進(jìn)行遺傳改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

供試草菇菌株V23和VH3由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；用于RNA提取的Trizol試劑盒購自上海賽百盛生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)、SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5購自上海天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；pGEM?-T Easy Vector System I、Taq DNA Polymerase in Storage Buffer B購自Promega公司；氯仿、異丙醇、乙醇購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司完成，測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 草菇菌絲的處理及收集

將固體培養(yǎng)的V23和VH3菌絲用勻漿器打碎并接入液體培養(yǎng)基中，32℃搖床中恒溫培養(yǎng)4 d，將兩菌株的菌絲放入0℃分別處理2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，然后用滅菌無紡布過濾，無菌水沖洗后滅菌濾紙吸干水分，將收集的正常生長(zhǎng)和低溫處理菌絲放入液氮中迅速冷凍，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 草菇菌絲總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

依照Trizol試劑盒說明書提取草菇菌絲的總RNA，用50 μL水溶解(DEPC預(yù)處理)，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。去除基因組DNA后，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為熒光定量PCR反應(yīng)模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 TP基因的生物信息學(xué)分析及編碼區(qū)的獲得

根據(jù)草菇表達(dá)譜中TP基因同源物種中該基因的登錄號(hào)，在NCBI中查找獲得其編碼區(qū)序列，與草菇全基因組序列信息比對(duì)，在GenBank中利用blastx比對(duì)DNA序列，依照真核生物去除內(nèi)含子的原則(GT-AG)去除可能的內(nèi)含子，獲得草菇TP基因的2232個(gè)核苷酸編碼區(qū)序列。

1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)低溫處理不同時(shí)間下草菇菌株內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)穩(wěn)定性和高拷貝數(shù)，選取α-微管蛋白(tubulin alpha，TUB)作為內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行定量。依據(jù)上述得到的草菇TP基因的編碼區(qū)序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物(引物序列如表1所示)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物

1.6 目的片段的擴(kuò)增與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備

采用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，并用1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)?zāi)康漠a(chǎn)物。將PCR的純化產(chǎn)物與pGEM?-T載體連接，制備標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，用于構(gòu)建RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。

1.7 TP基因的熒光定量測(cè)定

將經(jīng)梯度稀釋含有目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的質(zhì)粒作為模板，按照相對(duì)定量雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0℃處理不同時(shí)間的草菇菌絲的cDNA為模板，進(jìn)行目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的定量擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以ddH2O作為空白對(duì)照(擴(kuò)增反應(yīng)體系如表2所示)。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系

目的基因和內(nèi)標(biāo)基因定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 20 s；95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)已構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，表達(dá)量差異結(jié)果由Rotor-Gene 3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套軟件自動(dòng)生成。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取效果與目的片段的擴(kuò)增

將提取的RNA樣品在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從圖1可見提取的總RNA條帶清晰，28S的亮度為18S的2倍，5S彌散不明顯，說明RNA比較完整。常規(guī)PCR擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物條帶單一，說明引物的特異性較好，可以用于后續(xù)的定量PCR擴(kuò)增(圖2)。與此同時(shí)，克隆測(cè)序結(jié)果顯示目的基因序列均與原始序列完全一致。

α-微管蛋白基因序列長(zhǎng)度為114 bp：

CCAACACTACCGCTATCTCCTCGGCTTGGAGTCGCCTTGATCACAAGTTCGACCTCCTCTATTCGAAGCGTGCTTTCGTGCATTGGTACGTTGGTGAGGGTATGGAGGAAGGTG

海藻糖磷酸化酶基因序列為175 bp：

CGACCTGGAGGAATACCGAAAAACCGTCGGTCCCAAGACTTGGGCAACCGTTACCAAATTGGCAGACGAGTTACGAGAGAAGAAGGTCAAGATTGGTTTCTTCTCATCAACACCTCAGGGAGGTGGTGTTGCTTTGATGCGACATGCCTTGATCAGGTTCCTCCGTGCTCTTGAC

圖 1 草菇菌絲總RNA電泳圖

圖 2 目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增片段

M—DL2000 Marker； 1—TUB基因； 2—TP基因。

2.2 基因擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

含有TP基因質(zhì)粒的梯度稀釋擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線如圖3所示，該圖由Rotor-Gene 3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶的軟件生成，質(zhì)粒的5個(gè)稀釋濃度指數(shù)擴(kuò)增期的CT值都在10～30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)內(nèi)。圖4為含有TP基因質(zhì)粒梯度稀釋擴(kuò)增后的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且由表3可知，TP基因的擴(kuò)增效率為1.038，與CT值之間具有良好的線性關(guān)系，軟件生成的線性方程R2>0.99，可以用于對(duì)未知樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。根據(jù)線性方程，由樣品擴(kuò)增的CT值便可獲得樣品中模板的相對(duì)濃度。內(nèi)參基因(TUB基因)的標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建與模板相對(duì)濃度的計(jì)算方法同上。TP基因擴(kuò)增后的溶解曲線呈現(xiàn)單一峰(圖5)，表明TP基因的擴(kuò)增具有特異性，TP基因相對(duì)定量的結(jié)果可信。

圖3 海藻糖磷酸化酶基因的擴(kuò)增曲線

圖 4 海藻糖磷酸化酶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

基因Gene回歸方程Regression equationR2 ValueR2 ValueMM擴(kuò)增效率Reaction efficiencyTPconc= 10^(-0.309?CT + 7.995)0.99472-3.234031.03803TUBconc= 10^(-0.272?CT + 7.313)0.9969-3.670320.87265

圖5海藻糖磷酸化酶基因的溶解曲線

Fig 5 Melt curve ofTPgene

2.3 低溫脅迫下草菇菌絲海藻糖磷酸化酶基因表達(dá)變化

低溫處理下草菇V23、VH3菌株的內(nèi)參基因與目的基因經(jīng)RT-PCR后得到CT值(表4、表5)，并通過基因相對(duì)表達(dá)量的公式計(jì)算獲得相對(duì)含量(圖6)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算公式如下：

表4 低溫處理下草菇V23中TP的表達(dá)量

表5 低溫處理下草菇VH3中TP的表達(dá)量

草菇菌株V23的TP基因在未經(jīng)低溫處理時(shí)表達(dá)量最高，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量呈整體下降趨勢(shì)。在低溫處理2 h時(shí)，該基因表達(dá)量下降為0 h的0.88倍；到低溫處理4 h時(shí)，表達(dá)量急劇下降，僅為0 h的0.35倍；而在低溫處理6 h時(shí)，表達(dá)量有所回升，但仍低于未處理的對(duì)照，為0 h的0.42倍；隨著低溫處理時(shí)間的增加，到低溫處理8 h、10 h時(shí)，TP基因的表達(dá)量繼續(xù)降低并趨于穩(wěn)定，8 h達(dá)到最低值，僅為0 h的0.20倍，10 h與8 h水平較為接近，為0 h的0.22倍。草菇菌株VH3的TP基因在低溫處理2 h時(shí)表達(dá)量升高，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，都低于未經(jīng)低溫處理的對(duì)照水平。在低溫處理2 h時(shí)，該基因表達(dá)量達(dá)到了0 h的1.13倍；但隨著低溫處理時(shí)間的增加，表達(dá)量逐漸降低，到低溫處理4 h、6 h時(shí)，表達(dá)量分別下降至0 h的0.70倍和0.65倍；而在低溫處理8 h時(shí)，該基因表達(dá)量雖有所回升，但仍低于未處理時(shí)的表達(dá)量，為0 h的0.85倍；到低溫處理10 h時(shí)，又降低至6 h時(shí)相近水平，為0 h的0.66倍。

在低溫處理2 h時(shí)，V23和VH3的TP基因表達(dá)量有顯著區(qū)別，V23菌株中表達(dá)量降低，而VH3菌株中表達(dá)量穩(wěn)定。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，V23和VH3的TP基因均呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)，且V23的下降幅度要大于VH3。隨著處理時(shí)間增加的下降趨勢(shì)中，V23的TP基因在低溫處理6 h時(shí)表達(dá)量有所回升，VH3的TP基因在低溫處理8 h時(shí)表達(dá)量有所回升，但二者回升后的表達(dá)量仍低于各自未處理時(shí)的對(duì)照水平。

圖 6 低溫處理不同時(shí)間下V23和VH3中海藻糖磷酸化酶基因的表達(dá)量變化

3 討論

草菇屬高溫菇種，菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育需要相對(duì)較高的溫度，采摘后的子實(shí)體在常規(guī)4℃冷藏溫度下會(huì)出現(xiàn)軟化、滲水、褐變等自溶現(xiàn)象。后熟期草菇細(xì)胞強(qiáng)烈的呼吸作用以及多酚氧化酶、蛋白酶的作用都是引起自溶現(xiàn)象的原因，但尚無研究報(bào)道能夠清楚地闡釋該現(xiàn)象的作用機(jī)制[18]。我們?cè)诓莨交蚪M中比對(duì)得到與海藻糖磷酸化酶基因同源性較高的基因序列，并且在進(jìn)行草菇低溫表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因在V23與VH3中表達(dá)差異顯著，因此本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，驗(yàn)證海藻糖磷酸化酶基因與草菇耐低溫特性間的相關(guān)性，為今后對(duì)草菇耐冷性狀的遺傳改良提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，草菇低溫敏感型菌株V23在未受到低溫脅迫時(shí)，TP基因的表達(dá)量最高，受低溫處理后，其表達(dá)量持續(xù)下降，在8 h時(shí)降至最低值，并趨于穩(wěn)定。說明隨著低溫刺激的加劇V23菌絲細(xì)胞中代謝發(fā)生紊亂，細(xì)胞受到不可逆性損傷。草菇耐低溫型菌株VH3在受到低溫脅迫的最初2 h內(nèi)，TP基因的表達(dá)量沒有像V23菌株一樣出現(xiàn)降低，該基因表達(dá)量較為穩(wěn)定，達(dá)到了其0 h的1.13倍；說明低溫脅迫的最初2 h，可能未對(duì)VH3菌絲細(xì)胞內(nèi)的海藻糖含量造成影響，從而使海藻糖作為滲透保護(hù)劑能夠繼續(xù)維持胞內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定性。

雖然隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，VH3中TP基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但其TP基因的表達(dá)量下降幅度要小于V23。這說明VH3在受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞可能通過高表達(dá)海藻糖磷酸化酶基因，調(diào)節(jié)胞內(nèi)海藻糖含量，提高細(xì)胞液的粘稠度，從而維持滲透壓平衡，表現(xiàn)出比V23菌株更高的耐低溫特性。然而TP的催化作用具有可逆性，雖然有報(bào)道指出其催化方向更傾向于海藻糖的合成過程[19]，但它在草菇中的具體催化作用條件仍需要進(jìn)行深入研究。

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