宋新愛(ài)， 趙雪紅, 2， 任俊嬋， 樊小力

(1．西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研系， 西安 710061； 2．湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)部，襄陽(yáng) 441053； 3．西安電子科技大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，西安 710071)

如所周知，小腦深部有3對(duì)小腦核團(tuán)，小腦的所有調(diào)節(jié)功能均由其3對(duì)核團(tuán)輸出。其中間位核最終作用于脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，其主要功能在于利用外周感覺(jué)信息反饋控制肌張力，配合大腦皮層對(duì)進(jìn)行中的肢體運(yùn)動(dòng)和肌張力起適時(shí)的調(diào)節(jié)作用。研究資料表明[1-2]，模擬失重條件下肌梭的本體感覺(jué)和前庭的傳入活動(dòng)均發(fā)生改變，這必然會(huì)影響小腦間位核的功能。關(guān)于失重或模擬失重條件下肌肉運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)改變的研究資料很多[3-4]，但是參與調(diào)控肌肉運(yùn)動(dòng)功能的小腦間位核是否會(huì)發(fā)生變化，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

外周的傳入信息主要通過(guò)感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放谷氨酸，激活促離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptor，iGluRs)對(duì)間位核神經(jīng)元的活動(dòng)起興奮性的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究擬采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，觀察模擬失重14 d后大鼠小腦間位核內(nèi)iGluRs免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的變化，分析模擬失重對(duì)小腦功能的影響，探求模擬失重條件下肌肉運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)變化的機(jī)制, 進(jìn)而為制定有效的防護(hù)措施提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本研究采用健康活潑的Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠20只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重220～240 g。 按隨機(jī)配對(duì)原則分為2組：模擬失重14 d組(SUS 14 d)及正常對(duì)照組(Control, Con)，每組10只動(dòng)物。

1.2 模擬失重模型的建立

本研究采用經(jīng)典的Morey式大鼠尾部懸吊法建立模擬失重動(dòng)物模型[5]。 將大鼠尾部懸吊，使后肢懸空，身體長(zhǎng)軸與水平面呈30°，前肢自由活動(dòng)，動(dòng)物在籠內(nèi)可自由活動(dòng)、進(jìn)食和飲水。所有動(dòng)物均采用單籠飼養(yǎng)，室溫維持在20～25℃， 每晝夜均保持12 h循環(huán)光照與黑暗交替循環(huán)。

1.3 標(biāo)本制備

實(shí)驗(yàn)大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射(45 mg/kg)麻醉，經(jīng)主動(dòng)脈灌流固定，先注入溫生理鹽水200 mL后，迅速改用4%多聚甲醛灌注2 h。取出大鼠小腦，修整組織塊，并置入4%的多聚甲醛固定液后固定4～6 h， 30%蔗糖中4℃過(guò)夜。待組織下沉后進(jìn)行小腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度25 μm。常規(guī)組織切片裱片，室溫晾干，備用。

1.4 iGluRs免疫組織化學(xué)染色

分別選用兔抗NMDAR-1(1∶200)、KAR-2(1 μg/mL)和AMPAR-2(1 μg/mL)多克隆抗體 (Chemicon, Internationa, Temecula, CA)作為一抗，按ABC法常規(guī)操作進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用DAB顯色。染色后切片進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、封固。陰性對(duì)照分別設(shè)計(jì)針對(duì)一抗、二抗的替代試驗(yàn)，即分別用0.01 mol/L PBS來(lái)代替一抗，以上對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

1.5 數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)分析

在顯微鏡下(放大倍數(shù)10×20)，應(yīng)用HPIAS-2000 高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行iGluRs免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取陽(yáng)性細(xì)胞分布均勻的視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算各視野平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)值。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SEM表示。采用SPSS 10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異采用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05作為顯著性差異的界值。

2 結(jié)果

如圖1所示，iGluRs免疫反應(yīng)染色陽(yáng)性物呈棕黃色顆粒，主要分布在細(xì)胞的核周體及其突起上。iGluRs免疫陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元胞體分散地分布于間位核內(nèi)。這些細(xì)胞多呈圓形、三角形或多極形，細(xì)胞大小不均勻，神經(jīng)元胞體的直徑大約為30～80 μm。在缺乏一抗的對(duì)照小腦間位核的切片上，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)iGluRs免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示，與正常對(duì)照組相比大鼠吊尾14 d后，小腦間位核NMDAR-1、AMPAR-2和KAR-2的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P<0.05)。

圖1 大鼠小腦間位核促離子型谷氨酸受體免疫組化照片

Bar scale =50 μm. Arrow shows positive immunoreactivity. A1—NMDAR-1 in control group；A2—NMDAR-1 in suspension group; B1—AMPAR-2 in control group；B2—AMPAR-2 in suspension group; C1—KAR-2 in control group； C2—KAR-2 in suspension group.

表1 模擬失重后大鼠小腦間位核iGluRs免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化

*P< 0.05 as compared with the control.

iGluRs： ionotropic glutamate receptor； NMDAR-1： N-Methyl-D-Aspartate receptor-1；KAR-2: Kainic acid receptor-2；AMPAR-2: K-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor-2.

3 討論

小腦間位核神經(jīng)元活性受興奮和抑制兩種來(lái)源信息的調(diào)控。來(lái)自小腦皮層浦肯野細(xì)胞的軸突，通過(guò)末梢釋放抑制性遞質(zhì)GABA對(duì)間位核神經(jīng)元的活動(dòng)起抑制性的調(diào)節(jié)作用；而來(lái)自小腦苔狀纖維和爬行纖維的信息，其末梢釋放谷氨酸，通過(guò)激活iGluRs對(duì)間位核神經(jīng)元的活動(dòng)起興奮性的調(diào)節(jié)作用。

張浩[6]等的研究報(bào)道，模擬失重14 d后，大鼠脊髓小腦半球中間區(qū)的GABA免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。Krasnov等的研究表明[7-8]，模擬失重條件下浦肯野細(xì)胞功能活動(dòng)即降低。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：尾部懸吊14 d后，大鼠小腦間位核iGluRs的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，提示模擬失重可以引起小腦間位核神經(jīng)元iGluRs的功能增強(qiáng)。以上研究提示失重或模擬失重后，小腦間位核抑制性信息減少，而興奮性信息增多，即綜合的效果可能使小腦間位核的興奮性增強(qiáng)。

間位核的傳出纖維投射到對(duì)側(cè)的紅核大細(xì)胞，后者發(fā)出紅核脊髓束影響遠(yuǎn)側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)。間位核環(huán)路的興奮性增強(qiáng)，必然會(huì)興奮紅核細(xì)胞，進(jìn)而使外周的靶器官活動(dòng)增多。研究資料表明，人類歷經(jīng)航天飛行后，比目魚(yú)肌的強(qiáng)直肌電活動(dòng)明顯增加[9]。Canu[10]等也曾報(bào)道大鼠模擬失重2周后，在假想運(yùn)動(dòng)條件下，伸肌神經(jīng)的自發(fā)節(jié)律更加頻繁甚至連續(xù)。以上這些研究也間接提示，失重或模擬失重后，上位運(yùn)動(dòng)中樞的下行興奮作用增強(qiáng)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在模擬失重條件下，大鼠小腦間位核神經(jīng)元iGluRs免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。這一變化可能與失重或模擬失重引起的肌肉運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的適應(yīng)性變化有關(guān)。

參考文獻(xiàn):

[1]Dalecki M, Bock O. Changed joint position sense and muscle activity in simulated weightlessness by water immersion [J]. Aviat Space Environ Med, 2013, 84(2):110-115.

[2]Clarke A H, Just K, Krzok W, et al. Listing′s plane and the 3D-VOR in microgravity——the role of the otolith afferences [J]. J Vestib Res, 2013, 23(2):61-70.

[3]Yu Z B. Tetanic contraction induces enhancement of fatigability and sarcomeric damage in atrophic skeletal muscle and its underlying molecular mechanisms [J]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2013, 29(6):525-533.

[4]Sandonà D, Desaphy J F, Camerino G M, et al. Adaptation of mouse skeletal muscle to long-term microgravity in the MDS mission [J]. PLoS One, 2012, 7(3):e33232.

[5]Morey E R. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness [J]. Bioscience, 1979, 29 (3): 168-172.

[6]張 浩, 樊小力， 楊 威. 模擬失重對(duì)大鼠脊髓小腦內(nèi)γ-氨基丁酸免疫反應(yīng)性的影響 [J]. 中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 20(3): 212-215.

[7]Krasnov I B, Krasnikov G V. Purkinje′s cells in the vestibular and proprioceptive segments of rat′s cerebellum following 14-day space flight [J]. Aviakosm Ekolog Med, 2009, 43(4):43-47

[8]Krasnov I B, Krasnikov G V, Chel′naia N A. Effect of intermittent hypergravity on cerebellum Purkinje′s cells in suspended rats [J]. Aviakosm Ekolog Med, 2009, 43(3):39-43.

[9]Clement G, Gurfinkel V S, Lestienne F, et al. Adaptation of postural control to weightlessness [J]. Exp Brain Res, 1984, 57(1): 61-72.

[10]Canu M H, Falempin M, Orsal D. Fictive motor activity in rat after 14 days of hindlimb unloading [J]. Exp Brain Res, 2001, 139 (1): 30-38.