吳俊， 史雨紅， 張亮， 陳炯

(寧波大學 生物與海洋科學學院， 浙江 寧波 315211)

高遷移率族蛋白B1(High mobility group box protein 1，HMGB1)是一種廣泛存在于細胞核與細胞質(zhì)的進化高度保守的蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名。最初，研究認為HMGB1在細胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，對DNA重組、修復、復制和基因轉(zhuǎn)錄起重要作用[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可由單核細胞、巨噬細胞、垂體細胞、星形膠質(zhì)細胞等在炎癥介質(zhì)刺激下主動分泌至細胞外，也可由壞死細胞被動釋放至細胞外[2]。胞外HMGB1可與RAGE、TLR2、TLR4、TLR9等細胞表面受體結(jié)合，參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞趨化性移動、促炎因子釋放等活動[3-4]。最新研究還表明，HMGB1作為一種晚期細胞因子，在敗血癥患者血清和組織中含量明顯增加。臨床觀察也證實，敗血癥致死患者比幸存者體內(nèi)HMGB1含量更高。這一研究結(jié)果預示HMGB1可以作為藥物作用靶點，通過特異性抑制HMGB1的釋放與活性達到抗炎的目的，為炎癥晚期敗血癥的治療提供可能性[5-6]。目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中已有人(Homosapiens)、牛(BosTaurus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、雞(Gallusgallus)、非洲有爪蟾(Xenopus(Silurana)tropicalis)等多個物種的HMGB1基因，但是與哺乳動物相比，魚類中僅有大西洋鮭(Salmosalar)、斑馬魚(Daniorerio)、胡瓜魚(Osmerusmordax)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、鯽魚(Carassiusauratus)、裸蓋魚(Anoplopomafimbria)的HMGB1基因已被測定，未有深入研究。

香魚(Plecoglossusaltivelis, Sweetfish)屬胡瓜魚目，香魚科，是一種主要分布在中國、日本和朝鮮等東亞地區(qū)的經(jīng)濟名貴魚類。近年來，由于棲息環(huán)境破壞等因素，香魚病害成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要問題。其中，鰻利斯頓氏菌引起的病害病程短，發(fā)病率和死亡率高，并且感染的香魚表現(xiàn)出典型的細菌敗血癥的癥狀，對沿海地區(qū)的香魚養(yǎng)殖業(yè)危害較大[7]。因此，對鰻利斯頓氏菌感染后香魚的相關(guān)基因和蛋白的研究，有利于香魚細菌性疾病的防治，對香魚養(yǎng)殖業(yè)具有重要指導意義。

本文克隆并測定了香魚HMGB1基因的全長cDNA序列，闡明了它的結(jié)構(gòu)特性、系統(tǒng)進化關(guān)系及其mRNA在各組織中表達差異，并用qRT-PCR檢測鰻利斯頓氏菌感染后香魚肝臟、腦和肌肉HMGB1基因的mRNA的表達變化，旨在為進一步研究香魚HMGB1在炎癥中的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

健康香魚體重(53 ± 2)g，購自寧波水產(chǎn)大世界，ICR小鼠(雄)購自浙江省實驗動物中心。

大腸桿菌TG1、BL21 pLys E、鰻利斯頓氏菌香魚分離株(ayu-H080701)均由本實驗室保存。RNAiso試劑、cDNA Library Construction Kit、rTaqTM、dNTP、pMD19-T Simple Vector、NdeI、BamH I 購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit購自OMEGA公司；PCR引物合成以及序列測定由Invitrogen公司完成；其他實驗用化學藥劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物實驗

購買的香魚在實驗室條件(20 ± 1)℃下暫養(yǎng)，一周后隨機選取3尾健康香魚，取肝臟、脾臟、腎、腦、心臟、鰓、肌肉和腸共8個組織，快速放入液氮中，然后集中放入-80℃保存，用于不同組織表達差異分析。剩余的香魚分為兩組(12尾/組)，分別腹腔注射100 μL鰻利斯頓氏菌懸液(1.0×105CFU/mL PBS) (實驗組)和100 μL無菌PBS(對照組)。實驗組和對照組香魚分別于腹腔注射后24、48、72和96 h取樣，每次3尾/組[8]。

1.3 香魚HMGB1基因cDNA序列的獲得

使用RNAiso(TaKaRa)提取健康香魚肝臟樣品中總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000 (Thermo) 和瓊脂糖凝膠電泳檢測分析后，cDNA Library Construction Kit 構(gòu)建香魚肝臟組織cDNA文庫。隨機挑選287個克隆(插入片段≥800 bp)在Invitrogen公司進行序列測定，測序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上進行同源比對分析，雙向測通與GenBank中已知物種HMGB1基因序列相似的插入片段克隆[9]，進而獲得香魚HMGB1基因cDNA序列。

1.4 香魚HMGB1基因cDNA序列分析

將測序獲得的香魚HMGB1基因cDNA序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上進行同源比對，在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/上預測信號肽序列，與其他已知物種的HMGB1多重序列比對采用Bioedit程序，系統(tǒng)進化樹構(gòu)建采用MEGA 4.0[10]。

1.5 香魚HMGB1基因mRNA的組織表達特征

表1 PCR中用到的引物序列

提取香魚各組織樣品總RNA并合成cDNA，根據(jù)香魚HMGB1基因全長cDNA序列設計特異性引物(表1)，選取香魚β-actin基因作為內(nèi)參。采用qRT-PCR檢測HMGB1組織表達變化，為了確保qRT-PCR結(jié)果的準確性和可重復性，生物學重復3次。實驗數(shù)據(jù)根據(jù)Livak等人提出的相對標準曲線法2-ΔΔCt對相對定量的結(jié)果進行分析。

1.6 鰻利斯頓氏菌感染的香魚肝臟、腦和肌肉組織HMGB1基因mRNA表達變化

實驗組香魚各組織樣品總RNA提取、cDNA合成、qRT-PCR引物及方法同1.5。顯著性分析采用SPSS軟件(13.0)單因素方差分析法(One-way ANOVA)，以P< 0.05為顯著性差異。

1.7 香魚HMGB1基因的原核表達和抗血清制備

根據(jù)香魚HMGB1基因cDNA序列，設計一對含有限制性內(nèi)切酶NdeI和BamH I酶切位點(下劃線部分)的原核表達引物(表1)，以香魚肝臟cDNA文庫為模板，PCR擴增香魚HMGB1基因ORF序列，預期大小615 bp。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit純化。用于原核表達的pET-28a-HMGB1的構(gòu)建、重組蛋白誘導表達及抗血清制備同文獻[8]。

圖1香魚HMGB1與其他動物HMGB1氨基酸序列比對Fig 1 Multiple protein sequences aligment of HMGB1 from Sweetfish and other animals黑線部分代表HMGB1中A框、B框和酸性尾巴，黑色和灰色陰影分別代表氨基酸殘基的同一性和相似性，各物種HMGB1序列登錄號分別為：斑馬魚(BC045917)、虹鱒(BT073355)、裸蓋魚(BT082257)、鯽魚(FJ785327)、香魚(FR715330)、胡瓜魚(BT074445)、大西洋鮭(BT057530)、人(CR456863)、牛(BC102929)、雞(NM_204902)、小家鼠(BC100312)、熱帶爪蟾(BC063332)。

圖2 基于HMGB1基因氨基酸序列序列的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹Fig 2 Phylogenetic analysis of HMGB1 amino acid sequences using neighbor-joining method

2 結(jié)果

2.1 香魚HMGB1基因cDNA序列分析

核苷酸序列分析表明，HMGB1基因cDNA序列(EMBL登錄號FR715330)長1233個核苷酸(不含polyA尾)，5′端和3′端各有一段非編碼區(qū)，分別由22個和596個核苷酸組成，3′末端具有一個含18個A的poly(A)尾。該序列含有一個615 bp的開放閱讀框，編碼一個由204個氨基酸組成的分子量為23.3 kDa的蛋白，其理論等電點(pI)為6.78。分析還表明，該蛋白N端包括一個由22個氨基酸組成的信號肽序列，多腺苷酸化信號序列“TATAAA”位于第670～675位。HMGB1的結(jié)構(gòu)研究表明，其分子內(nèi)含有兩個約80aa組成帶正電的L型HMG框，分別是位于N端的A框(A-box)和位于分子中間的B框(B-box)。A框和B框與DNA均有很高的親和力，是結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)功能域。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在細胞外作為炎癥因子的生物學活性主要與B框有關(guān)，而A框?qū)框具有一定拮抗作用[11-12]。此外，HMGB1在C端還具有一個富含谷氨酸和天冬氨酸的帶負電的酸性尾巴(Acidic tail)，這一結(jié)構(gòu)在HMGB1的轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用[13](圖1)。

氨基酸序列比對表明，香魚HMGB1序列和其它已經(jīng)報道的魚類HMGB1同源性較高，其中，與胡瓜魚HMGB1蛋白同源性最高，為98%。系統(tǒng)進化樹分析表明，香魚HMGB1與其他魚類HMGB1同簇，與胡瓜魚進化相關(guān)性最高(圖2)。HMGB1在眾多物種中的廣泛存在以及氨基酸序列的高度同源性揭示, 該蛋白質(zhì)在動物的生命活動中發(fā)揮重要作用。

2.2 健康香魚HMGB1基因mRNA的組織表達特征

采用RT-PCR技術(shù)檢測健康香魚8種不同組織(肝臟、脾臟、腎臟、腦、心、鰓、肌肉、腸)中HMGB1基因的mRNA表達量。結(jié)果表明，HMGB1基因在肝臟、腦、肌肉中表達量最高，在脾臟、腎臟、心中表達量相近，而在鰓和腸中幾乎不表達(圖3)。

2.3 鰻利斯頓氏菌感染對香魚肝臟、腦和肌肉HMGB1基因mRNA表達的影響

為了進一步揭示HMGB1基因mRNA在不同組織中表達量與鰻利斯頓氏菌感染的關(guān)系，本研究選擇了HMGB1表達量最大的肝、腦和肌肉3個組織，qRT-PCR分析鰻利斯頓氏菌感染后24、48、72和96 h香魚HMGB1基因mRNA表達變化。結(jié)果表明：與對照組相比，肝臟HMGB1 mRNA在感染24 h后表達量顯著上調(diào)，48 h達到其峰值，為對照組的3.60倍，其后恢復健康香魚表達水平(圖4 A)；香魚腦中HMGB1基因mRNA表達量在48 h時急劇上調(diào)達到最高值，為對照組的22.9倍，之后增加趨勢趨緩，但仍然高于對照組(圖4 B)；香魚肌肉組織HMGB1基因mRNA表達量在感染48 h時，顯著上調(diào)(P< 0.05)，72 h達到峰值，為對照組的8.59倍(圖4 C)。

圖3 香魚HMGB1基因mRNA的組織表達特征

圖4 qRT-PCR分析鰻利斯頓氏菌感染的香魚肝(A)、腦(B)和肌肉(C) HMGB1基因mRNA表達變化

n=3；*：P< 0.05

圖 5 香魚HMGB1重組蛋白的原核表達和抗血清驗證

A: 經(jīng)IPTG誘導，香魚HMGB1重組蛋白SDS-PAGE圖。M: 低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)(kDa); 泳道1、2、3分別代表：空載pET-28a(+); pET-28a-HMGB1重組蛋白; 重組蛋白切膠純化產(chǎn)物; B: Western blot檢測HMGB1抗血清特異性, ECL顯影。1、2分別代表: 空載pET-28a(+); pET-28a-HMGB1重組蛋白。

2.4 香魚HMGB1的原核表達和抗血清制備

測序驗證后的pET-28a-HMGB1轉(zhuǎn)化表達菌株BL21 pLys E并由IPTG誘導重組蛋白表達，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測。結(jié)果顯示，目的蛋白成功表達，分子量大小約為25.3 kDa(圖5)，符合預期大小(23.3 kDaHMGB1成熟肽+2.0 kDa His-tag)。該目的蛋白經(jīng)切膠純化后，免疫小鼠制備抗血清。經(jīng)Western blot驗證，上述抗血清只能與重組的目的蛋白HMGB1起特異性反應，可用于后續(xù)相關(guān)研究。

3 討論

本研究測定了香魚HMGB1基因cDNA序列，它編碼一個由204個氨基酸組成的分子量大小為23.3 kDa的蛋白，N端包括信號肽(22個氨基酸)。結(jié)構(gòu)分析表明，香魚HMGB1的N端和分子中間分別具有一個A-box和B-box，C端還具有一個Acidic tail，這與已知的HMGB1結(jié)構(gòu)特征一致。系統(tǒng)進化樹分析表明，香魚HMGB1與其他已報道的魚類HMGB1高度相似，與胡瓜魚HMGB1蛋白同源性高達98%。

組織表達特征研究表明，健康香魚HMGB1基因在肌肉、腦和肝臟中表達量最高，在脾、腎、心中表達量相近，而在鰓和腸中幾乎不表達。在進一步實驗中，我們以鰻利斯頓氏菌感染香魚為模型，采用qRT-PCR技術(shù)檢測肝、腦和肌肉HMGB1基因mRNA表達變化。結(jié)果表明，肝臟HMGB1基因mRNA在感染24 h后表達量顯著上調(diào)，48 h達到其峰值；香魚腦中HMGB1基因mRNA表達量在48 h時急劇上調(diào)并達到最高值；香魚肌肉組織HMGB1基因mRNA表達量在感染48 h時顯著上調(diào)，在72 h時達到峰值，并持續(xù)保持較高表達水平。由此，揭示HMGB1基因mRNA在這3個組織中表達總體趨勢略有不同。據(jù)文獻報道，在這3個組織中，HMGB1功能也有所不同。在發(fā)育過程中或肌肉損傷時，HMGB1控制肌肉生成[14]，HMGB1表達水平的上調(diào)可能促進受損部位肌肉的修復。Sass等[15]在研究LPS刺激小鼠肝組織時發(fā)現(xiàn)，HMGB1基因mRNA在LPS處理后小鼠損傷肝組織中表達顯著上升。此外，HMGB1在腦中也發(fā)揮重要作用，可以誘導神經(jīng)突起延伸，而且外源添加的HMGB1可以提高神經(jīng)細胞存活率[16]。在斑馬魚為模型的實驗中，HMGB1是腦部發(fā)育的關(guān)鍵因子，能提高神經(jīng)前體細胞存活和促進增殖[17]。此外，鰻利斯頓氏菌感染香魚36 h時，鰭基部充血發(fā)紅，體表肌肉腐爛；解剖鰻利斯頓氏菌感染香魚，發(fā)現(xiàn)感病香魚的腹腔有大量腹水，腸道充血，脾和腎充血腫大，這與之前報道一致[9]。由HMGB1基因mRNA表達響應病原感染時間及出現(xiàn)峰值時間，我們推測，香魚HMGB1作為一種主要晚期炎性細胞因子[18]，在鰻利斯頓氏菌感染引起的炎癥反應中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，香魚肝、腦和肌肉組織中HMGB1基因可能與微生物感染引起的晚期炎癥反應相關(guān)。本研究為我們進一步探明香魚HMGB1的分子結(jié)構(gòu)及其在微生物感染引起的炎癥反應中的功能和作用機制打下基礎。

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