朱萬龍， 章迪， 高文榮， 王政昆

(云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 昆明 650500)

關(guān)于蜂猴屬(Nycticebus)的屬內(nèi)分類關(guān)系一直存在著不同的觀點(diǎn)。一些形態(tài)學(xué)家，如Dao[1]，Groves[2]，Petter和Petter-Rousseaus[3]，Hill[4]，Nowak[5]，Ma和Wang[6]，Groves[7]等支持蜂猴屬內(nèi)存在一至三個(gè)物種的觀點(diǎn)。根據(jù)形態(tài)學(xué)信息，Petter和Petter-Rousseaus[3]，Hill[4]，Weisenseel等[8]將蜂猴描述為一個(gè)物種，即蜂猴(Ncticebuscoucang)。Bonhote在1907年將倭蜂猴(N.pygmaeus)描述為一個(gè)獨(dú)立的物種[9]。Dao于1960[1]年描述了另一個(gè)越南物種，即，間蜂猴(N.intermedius)，認(rèn)為它是體型非常小的倭蜂猴和體型大的蜂猴之間的中間類型，而 Groves[2]研究表明間蜂猴只是倭蜂猴的成體形式。到2001年Groves[10]認(rèn)為蜂猴屬由3個(gè)物種組成，即N.coucang，N.pygmaeus和N.bengalensis，而N.coucang又分為3個(gè)亞種，即N.coucangcoucang，N.c.menagensis和N.c.javanicus，但是Java亞種的分類地位一直存在爭議，Supriatna和Hendras[11]認(rèn)為Java應(yīng)該是一個(gè)獨(dú)立的物種，而非N.coucang的亞種，因此認(rèn)為蜂猴屬由4個(gè)物種組成。目前最流行的觀點(diǎn)是由Ellerman和Morrison-Scott[12]提出的，蜂猴屬由兩個(gè)物種組成，即蜂猴(N.coucang)和倭蜂猴(N.pygmaeus)，但是至今為止學(xué)者們尚無統(tǒng)一的意見。

然而，以前有關(guān)蜂猴屬的分類關(guān)系主要是集中在形態(tài)學(xué)上的不同，比如身體大小、皮毛顏色、頭骨特征等。由于蜂猴屬物種和亞種水平的分類界限不清，使得除了形態(tài)學(xué)特征以外的其它分類特征具有更重要的價(jià)值。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)成為研究種群遺傳結(jié)構(gòu)的重要工具，已經(jīng)滲入到保護(hù)生物學(xué)、種群遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)等領(lǐng)域。在哺乳動(dòng)物的進(jìn)化研究領(lǐng)域中，線粒體DNA是一種廣泛使用的分子標(biāo)記，其特點(diǎn)是進(jìn)化速度快、母系遺傳和非重組變異等[13]。線粒體DNA中的細(xì)胞色素b(Cytb)基因適合于種群水平差異的檢測，普遍地用于動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究[14]，線粒體控制區(qū)(displacement loop region, D-loop)，是線粒體基因組中最主要的一段非編碼區(qū)，適合于檢測種群內(nèi)及種群間的遺傳變異[14]。

蜂猴屬的蜂猴(Nycticebuscoucang)和倭蜂猴(Ncticebuspygmaeus)都是國家一級保護(hù)動(dòng)物，并且2000年IUCN已將倭蜂猴列為易危物種(vulnerable)[15]，并被列入CITES附錄Ⅱ。因此，關(guān)于蜂猴屬(Nycticebus)的遺傳多樣性研究及其保護(hù)亟待進(jìn)行。本研究測定了蜂猴屬(Nycticebus)線粒體DNA 中的D-loop控制區(qū)部分序列和細(xì)胞色素b基因全序列(1140 bp)，旨在探討蜂猴屬內(nèi)物種之間的進(jìn)化關(guān)系，并對蜂猴屬物種的遺傳多樣性進(jìn)行分析。

1研究方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用材料來自昆明動(dòng)物園籠養(yǎng)倭蜂猴和云南大圍山自然保護(hù)區(qū)的糞便樣品，然后置于冰箱-20℃冷凍保存。其余部分序列來自GenBank(見表1和表2)。

1.2方法

1.2.1糞便DNA的提取

參考鐘華等[16]提出的用預(yù)冷的丙酮洗脫可以除去糞便中含有的大量PCR抑制物，并提取倭蜂猴的糞便DNA。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

Cytb基因的引物設(shè)計(jì)先采用Irwin等[17]報(bào)道的哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素b通用引物：

L14724：5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATC GTTG-3′

H15915：5′-CGGAATTCCATTTTTGGTTTACAAGAC-3′

然后再根據(jù)已經(jīng)測出的倭蜂猴Cytb基因序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)倭蜂猴的專一性引物為：

WFHCYTB—F：5′-AGACTCATGACTAACATTCGA-3′

WFHCYTB—R：5′-TAGGGCTGTGTCTTCATTTGAG-3′

D-loop控制區(qū)的引物采用Chen等[64]的報(bào)道：

L15996 ：5′-CTCCACCATGAGTAGCACCCAAAGC-3′

H16498 ：5′-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3′

1.2.3PCR擴(kuò)增

1)用dddH2O將合成的引物稀釋為溶度10 pmol/μL備用。

2)取200 μL的PCR小管至于冰盒中，編號(hào)備用。

3)Cytb基因和D-loop控制區(qū)的引物都先在下面的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，然后再根據(jù)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，總體積為50 μL 的PCR反應(yīng)體系各成分如下：ddH2O，38.5 μL；10×PCR Buffer，5 μL；MgCl2(25 mmol/ L)，2 μL；dNTP Mixture(10 mmol/L，pH值8.0)，1 μL；Primer 1(10 pmol/μL)，1 μL；Primer 2(10 pmol/μL)，1 μL；Template(10 ng/μL)，1 μL；Taq enzyme(4 U/μL)，0.5 μL。

4)調(diào)整好反應(yīng)程序，把PCR反應(yīng)管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件設(shè)定為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，48～55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃終止反應(yīng)。

5)反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

6)電泳檢測：取5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL 6×Loading Buffer，混勻后點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，穩(wěn)壓100V，電泳50 min，將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析并拍照保存。

7)根據(jù)電泳檢測的結(jié)果，如果擴(kuò)增出較好地目的片段，且沒有雜帶，那么這對引物的反應(yīng)條件就不再進(jìn)行優(yōu)化；如果未擴(kuò)增出目的片段或有較多雜帶，那么就需要在PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，通過調(diào)節(jié)退火溫度、循環(huán)次數(shù)、鎂離子濃度、dNTP 濃度、Taq酶和模板的濃度進(jìn)行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，直至得到最佳的PCR效果。

1.2.4 PCR的純化與測序

PCR 產(chǎn)物用1.5 %的瓊脂糖電泳檢測，在紫外透射儀上觀察，并割下亮帶。將割下的膠用Glassmilk DNA 純化回收試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品)進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序(測序使用試劑：ABI BigDye3.1；測序儀器：ABI 3730XL)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)處理

D-loop控制區(qū)部分序列和Cytb基因的測定結(jié)果使用DNASTAR軟件包的Editseq、Seqman、Megalign軟件進(jìn)行排序分析，將正反兩向序列進(jìn)行核對，并進(jìn)行人工的檢查和校正。用DNASP 4.0計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)以及統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目。用MEGA4.0進(jìn)行初始的序列比較，堿基組成分析和變異計(jì)算。利用Mega4.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)、最大簡約法(Maximum Parsimony, MP)和最小進(jìn)化法(Minimum Evolution, ME)構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹，重復(fù)抽樣1000次[18]，3種方法結(jié)果一致，因此結(jié)果中只顯示NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)樹。

表1本研究中D-loop控制區(qū)所使用的序列

2結(jié)果

2.1D-loop控制區(qū)和Cytb基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

D-loop控制區(qū)的擴(kuò)增片段為400 bp左右，Cytb基因的擴(kuò)增片段為1140 bp左右，結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 D-loop控制區(qū)序列及其變異情況

測定了來自蜂猴屬(Nycticebus)7個(gè)個(gè)體的樣品的mtDNA D-loop 5′ 控制區(qū)的部分序列，該序列鄰近tRNA-Pro基因，排序后得到的序列長度約為400 bp。其中兩條蜂猴序列(編號(hào)為Ncou1和Ncou2)，連同來自GenBank的孟加拉蜂猴的同源序列(編號(hào)為Nben1～Nben9)分析發(fā)現(xiàn)了22個(gè)變異多態(tài)位點(diǎn)，包括11個(gè)簡約信息多態(tài)位點(diǎn)和11個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)。多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)為22，核苷酸多樣性(Pi)為0.01665，平均核苷酸差異數(shù)(K)為6.509。而另外的5條倭蜂猴序列(編號(hào)為N1～N5)和來自GenBank的倭蜂猴的同源序列(編號(hào)為Npgy1～Npgy10)分析發(fā)現(xiàn)了9個(gè)變異多態(tài)位點(diǎn)，包括3個(gè)簡約信息多態(tài)位點(diǎn)和6個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)。S為9， Pi為0.00516， K為1.924。

表2 本研究Cyt b基因檢測的物種

圖1 D-loop控制區(qū)基因片段的擴(kuò)增結(jié)果(1.5%的瓊脂糖凝膠電泳)

Fig 1 A gene segment amplified from D-loop control region(1.5% agarose gel)

2.3Cytb基因序列及其變異情況

對本研究測定的8個(gè)倭蜂猴樣本Cytb基因序列(編號(hào)為N1～N8)和來自GenBank的倭蜂猴的同源序列(編號(hào)為Npgy1～Npgy6)進(jìn)行多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析得出S為1，Pi為0.00128，K為0.495，共發(fā)現(xiàn)核苷酸變異位點(diǎn)1個(gè)，簡約信息位點(diǎn)1個(gè)，沒有發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。

圖2 Cyt b基因片段的擴(kuò)增結(jié)果(1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳)

圖3 基于線粒體D-Loop控制區(qū)構(gòu)建的NJ樹

2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于本研究所得到的D-loop控制區(qū)序列和在GenBank上所查的序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(圖3)，結(jié)果顯示，本研究所測定的樣品與已報(bào)道的倭蜂猴個(gè)體聚成一支，證明所測定的樣品是真正的倭蜂猴個(gè)體。N.bengalensis和N.coucang聚在一個(gè)分支。拓?fù)鋱D還提示，蜂猴屬由兩支組成，且分支置信度較高，即自舉檢驗(yàn)值(Bootstrap)為1000次自舉檢測得到的對該支的支持百分?jǐn)?shù)較高。同樣，基于本研究所得到的Cytb基因序列和在GenBank上所查的序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(圖4)，結(jié)果顯示，蜂猴屬的物種主要分為兩個(gè)類群，本研究得到的8個(gè)樣品和已報(bào)道的倭蜂猴個(gè)體聚在一起形成一支，其它的聚為一支，它包括除了倭蜂猴(N.pygmaeus)之外的其它分類單位。而且在后一個(gè)進(jìn)化枝中，又分為兩個(gè)亞進(jìn)化枝，其中一支僅由N.coucangjavanicus組成，另一支由N.coucangcoucang，N.coucangmenagensis和N.coucang組成，但是這三者的分辨力不強(qiáng)。

圖4 基于線粒體Cyt b基因全序列構(gòu)建的NJ樹

3討論

3.1 遺傳多樣性分析

本研究主要基于線粒體DNA中的D-loop控制區(qū)和Cytb基因?qū)Ψ浜飳俚倪z傳多樣性進(jìn)行探討。基于D-loop控制區(qū)部分序列對兩條蜂猴序列，連同來自GenBank的孟加拉蜂猴的同源序列遺傳變異分析表明，其多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為22，核苷酸多樣性為0.01665，平均核苷酸差異數(shù)為6.509。而對5條倭蜂猴序列和來自GenBank的倭蜂猴的同源序列分析僅僅發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)9，核苷酸多樣性為0.00516，平均核苷酸差異數(shù)為1.924。分析數(shù)據(jù)表明，雖然倭蜂猴的樣本大小相比之蜂猴的樣本大小較大，但是倭蜂猴的多態(tài)水平反之卻比蜂猴的多態(tài)水平低得多。假定這兩個(gè)物種之間具有相似的突變速率，蜂猴的多態(tài)水平增加可能由群體的結(jié)構(gòu)特征所產(chǎn)生，也可能由來自其他棲息地群體的可能的基因交流所造成。

3.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

有關(guān)蜂猴屬內(nèi)物種之間的分類進(jìn)化關(guān)系一直都沒有統(tǒng)一的意見，由于形態(tài)學(xué)上的相似性導(dǎo)致了其在物種和亞種水平界定上的困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物進(jìn)化的研究也從宏觀趨向微觀。Chen等[19]對蜂猴屬的核型進(jìn)行了研究；Zhang等[20]對蜂猴屬的線粒體DNA進(jìn)行了RFLP分析；Wang等[21]對蜂猴屬的核糖體DNA進(jìn)行了分析研究。到2001年呂雪梅等[22]測定分析了蜂猴屬的細(xì)胞色素b基因的全序列。本研究基于D-loop控制區(qū)部分序列和Cytb基因序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(圖3和圖4)可以看出，本研究測定的倭蜂猴樣品與已報(bào)道的倭蜂猴個(gè)體聚成一支，說明它很可能是真正的倭蜂猴個(gè)體。而且無論是基于D-loop控制區(qū)部分序列構(gòu)建的鄰接樹，還是基于Cytb基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，都清晰地表明這些序列聚成的分支與其它分類支都是分開的，而且分支置信度為100%。因此本研究認(rèn)為倭蜂猴是完全獨(dú)立的物種。這與Chen等[23]的觀點(diǎn)是一致的。

孟加拉蜂猴最初被命名為N.coucang的一個(gè)亞種，但是Groves[7]年將其作為一個(gè)獨(dú)立的物種。根據(jù)本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析，N.bengalensis樣本與N.coucang的兩個(gè)樣本也是共同聚成一個(gè)進(jìn)化枝，而且自舉檢驗(yàn)值較高。因此并不認(rèn)為孟加拉蜂猴是一個(gè)獨(dú)立的物種。根據(jù)Groves[10]的觀點(diǎn)，N.coucang包含3個(gè)亞種，N.scoucangcoucang，N.c.menagensis和N.c.javanicus，它們之間通過形態(tài)學(xué)的特征很難完全地辨別區(qū)分，而且第3個(gè)Java亞種的分類地位一直存在爭議，Supriatna和Hendras[11]認(rèn)為Java亞種應(yīng)該是一個(gè)獨(dú)立的物種，因此認(rèn)為蜂猴屬由4個(gè)物種組成。然而，本研究基于細(xì)胞色素b基因序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹并不支持這一觀點(diǎn)，N.c.javanicus雖然首先和其它兩個(gè)亞種分開，但這3個(gè)亞種還是共同聚在一起形成一個(gè)亞進(jìn)化分支。也就表明了N.c.javanicus很可能還是N.coucang的一個(gè)亞種，并沒有進(jìn)化形成一個(gè)獨(dú)立的物種。

總之，本研究通過對蜂猴屬的D-loop控制區(qū)部分序列和細(xì)胞色素b基因全序列的分析，結(jié)果支持Ratajszczak[9]和Groves[2]的觀點(diǎn)，即認(rèn)為蜂猴屬由兩個(gè)單系群組成：第一群由N.pygmaeus聚成，第二群由N.coucang聚成。該結(jié)果也提供了新的分子遺傳證據(jù)，支持蜂猴屬由N.coucang和N.pygmaeus兩物種組成。

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