張金華，Gulzar Khan，付鵬程，雷淑云，陳世龍，張發(fā)起

(1. 中國(guó)科學(xué)院 高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所，西寧 810001； 2. 青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

微衛(wèi)星是DNA短的串聯(lián)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)，一般是由1～6個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列[1, 2]。研究表明SSR存在于絕大多數(shù)的真核生物基因組中[3]。其中最常見(jiàn)的SSR序列為(AC)n，約有5×104～7×105隨機(jī)分散于整個(gè)基因組中，其重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度在不同的物種間高度變化[4]。由于SSR具有高度多態(tài)性和共顯性等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性研究、物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等[5]。

傳統(tǒng)的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)方法是利用菌落原位雜交技術(shù)篩選出重組克隆，然后經(jīng)測(cè)序篩選含微衛(wèi)星序列的DNA片段，構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，但該方法耗時(shí)費(fèi)力及篩選效率較低[6]。隨著微衛(wèi)星分離技術(shù)的發(fā)展，磁珠富集法于1992首次提出，其主要是將酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增后與生物素標(biāo)記的探針雜交，然后用磁珠富集，從而獲得富含SSR序列的片段，從而構(gòu)建微衛(wèi)星文庫(kù)[7]。由于這一方法操作簡(jiǎn)單且獲得SSR分子標(biāo)記效率高而快速發(fā)展。但目前利用磁珠富集法開(kāi)展繡線菊SSR分子標(biāo)記的工作還很少見(jiàn)[8]。

圖1 菌落PCR檢測(cè)的瓊脂糖電泳圖譜(25泳道為分子量標(biāo)記：DNA maker DL2000)Fig 1 Profile of the PCR amplification of screening of colony (Lane 25 is the DNA molecular maker: DL2000 )

繡線菊亞科(Spiraeoideae)是薔薇科(Rosaceae)中最古老的亞科，共有22屬260余種，中國(guó)有8屬100余種，全為落葉性(本亞科包括常綠和落葉兩大類群，后者為進(jìn)化類群)，繡線菊屬(SpriaeaL.)又是繡線菊亞科中最原始的屬，在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中，衍生出形態(tài)各異而親緣關(guān)系緊密的繡線菊種類[9]。高山繡線菊(Spiraeamongolica)和蒙古繡線菊(Spiraeamongolica)同為薔薇科繡線菊屬落葉灌木，多見(jiàn)于海拔1500～4700 m的山坡灌叢等處，是青藏高原地區(qū)高山灌叢的主要建群種，對(duì)維持高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用[10]。在之前對(duì)高山繡線菊的譜系地理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高山繡線菊在青藏高原臺(tái)面、東南邊緣橫斷山區(qū)等地存在多個(gè)冰期避難所，并且沒(méi)有表現(xiàn)出大規(guī)模的種群集體擴(kuò)張和遷移的現(xiàn)象[11, 12]。但這一結(jié)果僅利用葉綠體DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由于缺少SSR分子標(biāo)記而沒(méi)有進(jìn)行該方面的檢驗(yàn)，不能夠完整地展現(xiàn)高山繡線菊的冰期進(jìn)化歷史等問(wèn)題。因此，本研究利用微衛(wèi)星富集法從高山繡線菊基因組DNA中分離和獲得SSR分子標(biāo)記，并驗(yàn)證其在蒙古繡線菊的通用性，以期為繡線菊的分類、譜系地理、系統(tǒng)發(fā)育等研究提供豐富的SSR分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料主要采自青海囊謙和四川紅原。其中，每個(gè)居群隨機(jī)采集20～27個(gè)個(gè)體，每個(gè)居群內(nèi)采樣個(gè)體之間至少間隔100 m，共采集到兩種繡線菊4個(gè)居群92個(gè)個(gè)體(表1)。采集植物生長(zhǎng)良好的新鮮、幼嫩葉片后，迅速用硅膠干燥并帶回實(shí)驗(yàn)室于-20℃保存?zhèn)溆?。憑證標(biāo)本存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)。

1.2 高山繡線菊基因組DNA提取

采用改良的CTAB法提取高山繡線菊和蒙古繡線菊基因組DNA，并用乙醇沉淀法對(duì)DNA初提母液進(jìn)行純化[13]。用紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)NanoDropTM2000c(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定純化后的基因組DNA濃度，調(diào)整DNA總的質(zhì)量濃度為100 ng/μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取結(jié)果。

表 1 高山繡線菊和蒙古繡線菊采集信息

1.3 微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建

1.3.1 基因組DNA酶切、接頭連接及PCR擴(kuò)增

用MseI內(nèi)切酶(New England Biolabs，美國(guó))對(duì)高山繡線菊的基因組DNA(約200 ng)酶切3～4 h。用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切結(jié)果。將合成的鏈A(5′-TAC TCA GGA CTC AT-3′)和鏈B(5′-GAC GAT GAG TCC TGA G-3′)配成20 pmol/μL溶液。分別取鏈A和B溶液各50 μL于1.5 mL離心管中混合。升溫至80℃后，變性5～10 min。在室溫下自然冷卻1 h，加dd H2O配成終濃度為10 pmol/μL的接頭溶液，于-20℃保存。用T4 DNA連接酶(New England Biolabs，美國(guó))將酶切產(chǎn)物與接頭溶液于16℃恒溫下連接5 h。以此連接產(chǎn)物為模板用簡(jiǎn)并引物MseⅠ-N [5′-GAT GAG TCC TGA GTA A (N)-3′] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)接頭連接結(jié)果。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：連接產(chǎn)物2 μL，2.5 μL的10×PCR Buffer(含1.5 mmol/L MgCl2)，0.3 μL 10 mmol/L dNTP，正反引物各1.0 μL(5 pmol/L)，1 U Taq DNA聚合酶(TaKara，大連)，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；30個(gè)循環(huán)的94℃加熱變性1 min，53℃退火45 s，72℃延伸45 s；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.2 探針雜交、磁珠富集及文庫(kù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物先95℃變性5 min后，與0.5 μmol/L生物素標(biāo)記SSR探針 (AC)15和 (AG)15、4×SSC、0.1% SDS混合后在48℃雜交2 h。雜交液加至用TEN100(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH值7.5)的平衡好1 mg鏈霉親和素磁珠(New England Biolabs，美國(guó))混合液中，室溫恒溫振蕩溫浴30 min，用磁架吸附管壁，將磁珠與混合液分離，棄混合液。然后依次用TEN1000(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，pH值7.5)漂洗2次，含0.1% SDS的0.2×SSC漂洗兩次之后，加入100 μL TE重懸磁珠，95℃變性 5 min后，迅速用磁架吸附管壁將磁珠與混合液分離，保存上清液。以獲得的上清液為模板用簡(jiǎn)并引物MseI-N進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)富集結(jié)果。PCR反應(yīng)體系和程序與1.3.1中檢測(cè)接頭連接時(shí)相同。富集良好的PCR產(chǎn)物用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit(TaKara，大連)回收純化后，與pMD19-T載體(TaKara，大連)連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coliDH5α)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)。

1.4 文庫(kù)篩選、測(cè)序、序列分析及引物設(shè)計(jì)

將帶有目的片段的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞涂抹于含有Ampcillin (100 μg/mL)、X-gal(50 mg/mL)、IPTG(0.1 mol/L)的LB-瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色菌落于含Ampcillin的LB液體培養(yǎng)基中活化。以此活化菌液為模板，用載體通用引物和探針序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選重組克隆。陽(yáng)性克隆通過(guò)中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室ABI 3730xl型基因測(cè)序儀(Applied Biosystems，加拿大)進(jìn)行DNA測(cè)序。

運(yùn)用CLUSTAL X、MEGA和DNAsp對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行分析，并加以手工校對(duì)[14-16]。利用SSRHunter軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析[17]，獲得含有微衛(wèi)星序列的片段。通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Primer3對(duì)獲得的含有微衛(wèi)星序列的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[18]。

1.5 SSR標(biāo)記引物多態(tài)性篩選

用高山繡線菊和蒙古繡線菊的4個(gè)野外居群(表1)進(jìn)行SSR標(biāo)記引物多態(tài)性篩選。PCR反應(yīng)采用15 μL體系：10～100 ng DNA模板，1.5 μL的10×PCR Buffer(含1.5 mmol/L MgCl2)，0.15 μL 10 mmol/L dNTP，正反引物各0.5 μL(5 pmol/L)，0.5 UTaqDNA聚合酶(TaKara，大連)，用ddH2O補(bǔ)足15 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min；30個(gè)循環(huán)的94℃加熱變性50 s，51℃～54℃(不同引物在不同物種中的退火溫度不同，表2)退火45 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用QIAxcel Advanced 高效毛細(xì)管電泳儀(QIAGEN，德國(guó))分析。

利用GENEPOP version 4.0.10計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量(number of alleles per locus)(A)、觀察雜合度(observed heterozygosities；HO)，期望雜合度(expected heterozygosities；HE)[19]。Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)用確切性概率方法(exact probability test)在GENEPOP中完成[19, 20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 含目的片段陽(yáng)性克隆篩選、測(cè)序及引物設(shè)計(jì)

以菌液為模板，用PCR法共篩選單克隆。產(chǎn)生兩條或兩條以上的擴(kuò)增條帶含有插入片段的陽(yáng)性克隆262個(gè)(如圖1中泳道1、2、3等)，隨機(jī)挑選其中120個(gè)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)獲得的120條序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示其中111條序列(92.5%)為唯一序列，其他9條序列均為同一重復(fù)序列。SSRHunter軟件對(duì)112條序列共檢測(cè)到321個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，平均每個(gè)克隆含有2.8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。挑選其中60條序列用引物設(shè)計(jì)軟件Primer3設(shè)計(jì)出60對(duì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和程序，其中21對(duì)引物能在高山繡線菊和蒙古繡線菊中成功擴(kuò)增，其中5對(duì)引物在初期篩選中未呈現(xiàn)出多態(tài)性，其余16對(duì)多態(tài)性引物的序列及GeneBank登記號(hào)在表2中詳細(xì)列出。

2.2 多態(tài)性標(biāo)記篩選

用獲得的16對(duì)多態(tài)性引物(表2)對(duì)高山繡線菊和蒙古繡線菊的4個(gè)居群的92個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用QIAxcel Advanced 高效毛細(xì)管電泳儀分析。圖2所示為引物SA2對(duì)繡線菊的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜。

表2 兩種繡線菊部分有效擴(kuò)增的微衛(wèi)星引物

注：SA, 高山繡線菊Spiraeaalpina;SM, 蒙古繡線菊Spiraeamongolica。

圖2 引物SA2部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物QIAxcel Advanced 高效毛細(xì)管電泳圖譜Fig 2 Profile of QIAxcel Advanced System with PCR production based on primer SA2

利用GENEPOP分析顯示，高山繡線菊(P1和P2)中16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因數(shù)(A)在3～18，觀察雜合度介于0.043～0.870之間，期望雜合度的變化范圍為0.126～0.950。在蒙古繡線菊中，這3個(gè)范圍分別為：4～30、0.040～1.000、0.544～0.968。基于確切性概率方法的Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高山繡線菊和蒙古繡線菊的某些群體在多個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，其中兩個(gè)物種在SA2、SA6及SA10三個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了顯著偏離(表3)。相比高山繡線菊，蒙古繡線菊的兩個(gè)居群在11個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了顯著偏離。

3 討論

磁珠富集法使得SSR陽(yáng)性克隆的獲得率大大提高，傳統(tǒng)的構(gòu)建、篩選小插入片段基因組文庫(kù)分離SSR遺傳標(biāo)記的方法中，陽(yáng)性克隆的獲得效率較低，只有1%～3%。多個(gè)研究表明磁珠富集法可以使得SSR陽(yáng)性克隆的獲得率提高至50%～60%[21]。本研究選取120個(gè)進(jìn)行測(cè)序的克隆中，82個(gè)含有微衛(wèi)星序列，獲得率達(dá)到68.3%。近來(lái)通過(guò)高通量測(cè)序獲得海量 EST序列(expressed sequence Tag)，基于 EST序列大量開(kāi)發(fā) SSR 引物標(biāo)記的方法正越來(lái)越引起人們的關(guān)注，然而由于高通量測(cè)序的成本較高，至少為磁珠富集法的5～8倍，其在研究中的應(yīng)用還很有限。因此，作為一種快速,高效而廉價(jià)的微衛(wèi)星標(biāo)記分離方法，磁珠富集法在目前研究中得到廣泛應(yīng)用。此外，本研究用QIAxcel Advanced毛細(xì)管電泳代替了傳統(tǒng)的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，該系統(tǒng)采用即用型的預(yù)制膠卡夾，能在最短的手工操作時(shí)間內(nèi)分析96個(gè)樣品，減少了人為操作誤差，確保了便捷的數(shù)據(jù)分析和記錄。

與多個(gè)其他類群的研究相比，繡線菊的4個(gè)居群的平均等位基因數(shù)、平均期望雜合度及平均觀測(cè)雜合度都比較高，說(shuō)明這16個(gè)位點(diǎn)在兩種繡線菊中都具有較高的多態(tài)性，可以用于后續(xù)的遺傳多樣性、物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等方面的研究[5]。微衛(wèi)星多態(tài)性篩選中發(fā)現(xiàn)，64個(gè)數(shù)據(jù)系列(4個(gè)居群×16個(gè)位點(diǎn))中26個(gè)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能是無(wú)效等位基因的存在。等位基因在理想群體中的頻率是穩(wěn)定的，無(wú)效等位基因的出現(xiàn)會(huì)引起等位基因頻率的改變，從而導(dǎo)致繡線菊的居群在這些位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡[22]。

表3 兩種繡線菊居群遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：*，顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

有研究利用桉樹(shù)隨機(jī)基因組序列設(shè)計(jì)的SSR引物，在桉樹(shù)屬不同種間通用性約為78%[23]，在桃金娘科不同屬間仍具有30%以上的通用性[24]。利用玉米的SSR引物對(duì)棉花進(jìn)行通用新分析發(fā)現(xiàn)，91%的引物能夠成功擴(kuò)增[25]。這是由于EST-SSR來(lái)源于編碼區(qū)，因此在物種間具有很高的保守型。本研究是利用高山繡線菊的基因組DNA為材料進(jìn)行SSR引物的開(kāi)發(fā)，隨機(jī)設(shè)計(jì)的60對(duì)引物中，21對(duì)引物能在高山繡線菊和蒙古繡線菊中成功擴(kuò)增，其中16對(duì)在兩個(gè)物種中均呈現(xiàn)較高的多態(tài)性。這說(shuō)明在兩種繡線菊中SSR引物的通用性也較高，本研究開(kāi)發(fā)的16對(duì)SSR引物在繡線菊屬的遺傳學(xué)研究中具有較高的價(jià)值。在對(duì)繡線菊屬的其他物種開(kāi)展研究工作中，可以從已獲得的高山繡線菊微衛(wèi)星富集文庫(kù)中尋找合適的微衛(wèi)星位點(diǎn)，從而減少開(kāi)發(fā)成本和提高實(shí)驗(yàn)效率。

近來(lái)，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行的遺傳多樣性分析多有報(bào)道。通過(guò)篩選苜蓿的16對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物獲得了190個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)這些SSR引物能夠較好地檢測(cè)不同苜蓿材料的遺傳多樣性[26]。利用自主開(kāi)發(fā)的52對(duì)杉木SSR引物，對(duì)國(guó)家級(jí)杉木種質(zhì)資源庫(kù)保存的遺傳材料分析表明SSR分子標(biāo)記聚類的結(jié)果可為種質(zhì)資源的管理及提高育種效率提供重要依據(jù)[27]。因此，本研究開(kāi)發(fā)的SSR多態(tài)性引物將為繡線菊遺傳多樣性分析、物種進(jìn)化與親緣關(guān)系、種質(zhì)資源利用、育種群體的建立等奠定基礎(chǔ)。

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