袁華玲, 金黎平, 黃三文, 李 穎, 屈冬玉

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081; 2.合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，合肥 230601)

植物原生質(zhì)體是開展遺傳理論研究良好的試驗(yàn)材料，以原生質(zhì)體為材料可以從遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、植物生理學(xué)角度對細(xì)胞起源、細(xì)胞壁的生物合成、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系以及植物激素作用機(jī)理等方面進(jìn)行研究。原生質(zhì)體還是遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想受體，沒有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體比較容易攝取外源的DNA、細(xì)胞器、病毒、質(zhì)粒等，可以有目的地轉(zhuǎn)入特定基因，改良作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等。原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株過程中，往往會產(chǎn)生無性系變異，同時原生質(zhì)體也可以通過理化因素誘變得到突變體，經(jīng)適當(dāng)篩選可選出有利用價值的變異體。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠克服雜交不親和，進(jìn)行遠(yuǎn)緣的體細(xì)胞雜交，創(chuàng)造新種質(zhì)，因此植物原生質(zhì)體在改變植物遺傳性、改良作物品種的應(yīng)用研究以及生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究中有著廣泛的用途[1, 2]。

馬鈴薯是原生質(zhì)體培養(yǎng)研究較多的物種，有不少成功的報(bào)道[3-6]，涉及的材料有四倍體栽培種、雙單倍體品系和野生種，供體材料有葉片、塊莖、芽、實(shí)生苗子葉及下胚軸游離細(xì)胞，其中以葉片游離細(xì)胞來源的居多，但是馬鈴薯原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的程序多樣，多數(shù)只是經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，未能使技術(shù)達(dá)到系統(tǒng)化、程序化，存在著重復(fù)性和通用性較差的問題，有待于進(jìn)一步研究。

中國馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)起步晚，培養(yǎng)成功的二倍體和雙單倍體的基因型較少，本研究選用抗青枯病二倍體材料、炸片顏色好的二倍體材料以及具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的雙單倍體，對馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行研究，以期為利用體細(xì)胞雜交技術(shù)選育馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以馬鈴薯抗青枯病二倍體材料ED13和CE171、炸片顏色好的二倍體材料HS66以及優(yōu)良性狀雙單體材料DH401和DH405為供體材料。其中ED13和CE171來源于馬鈴薯ED和CE分離群體，ED分離群體的親本為E(772102.37)、D(USW7859)、C(USW5337)，其中E來源于二倍體抗青枯病原始栽培種S.phureja.和S.vernei, 其遺傳背景見文獻(xiàn)[7]。HS66引自美國，DH401和DH405引自加拿大。供體材料培養(yǎng)在含2% 蔗糖和1 mg/L STS 固體MS培養(yǎng)基上，試管苗培養(yǎng)在25℃±1℃的培養(yǎng)室中, 光照強(qiáng)度54～60 μmol/ m2/s，每天16 h光照。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理方法

葉片懸浮黑暗預(yù)培養(yǎng)是在無菌條件下剪取試管苗上部葉片約1 g，按Haberlach等人方法[3]進(jìn)行。植株黑暗處理是將苗齡3周的試管苗連同三角瓶置于25℃黑暗中48 h。

1.2.2 原生質(zhì)體分離、純化和培養(yǎng)

原生質(zhì)體分離純化程序參照按周宇波方法[8]略修改，酶解液基本組成為CPW，附加PVP、甘露醇、BSA、MES、纖維素酶和離析酶，酶解后純化，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量，F(xiàn)DA染色后熒光顯微鏡下觀察生活原生質(zhì)體數(shù)，計(jì)算原生質(zhì)體活力。純化后的原生質(zhì)體密度調(diào)整為5×105個/mL，取600 μL加6 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。25℃黑暗培養(yǎng)1周后，逐漸轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，在15 d左右用稀釋培養(yǎng)基稀釋8～10倍，繼續(xù)光下培養(yǎng)。培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)條件為，溫度25℃ ± 1℃, 光照強(qiáng)度54～60 μmol/ m2/s，每天16 h光照。

原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中生長成1 mm大小的愈傷組織時，將其轉(zhuǎn)移到愈傷組織生長培養(yǎng)基中。2周后，將生長到3～4 mm的愈傷組織轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，當(dāng)誘導(dǎo)出的芽生長到1 cm長時，將芽切下接種到固體MS培養(yǎng)基中，植株生長并生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

植物細(xì)胞的生理狀態(tài)以及細(xì)胞是否耐受損傷具有較強(qiáng)的修復(fù)能力影響原生質(zhì)體培養(yǎng)。預(yù)處理是在酶解前通過對材料的處理，改變細(xì)胞和細(xì)胞壁的生理狀態(tài)，增加細(xì)胞膜的耐受度，減少原生質(zhì)體損傷，提高酶解效率。以ED13為材料，用葉片懸浮黑暗預(yù)處理和試管苗黑暗預(yù)處理兩種不同的方法對供體材料進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后取約1 g葉片進(jìn)行酶解分離，酶解液CPW附加2%PVP、0.5 mol/L甘露醇、0.2%BSA、3 mmol/L MES、0.3%纖維素酶和0.1%離析酶，酶解12 h。結(jié)果見表1。由表1可以看出，兩種預(yù)處理方式對原生質(zhì)體活力無顯著影響。從減少操作環(huán)節(jié)、降低污染的可能性的角度來說，試管苗黑暗預(yù)處理方式要優(yōu)于葉片懸浮黑暗預(yù)處理方式。

表1 預(yù)處理方式對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

注：表中英文字母相同的數(shù)值間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 酶解液組成及酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響

2.2.1 酶解液中滲透壓對原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性的影響

圖1 酶解液中不同濃度甘露醇對電導(dǎo)率的影響

由于原生質(zhì)體本身穩(wěn)定性差，很容易破碎，為保持釋放出的原生質(zhì)體具高活力，酶解液中常加入滲透劑以維持一定的滲透壓，應(yīng)用最廣泛的是甘露醇和山梨醇。當(dāng)細(xì)胞膜受到傷害時，細(xì)胞的通透性增大，細(xì)胞膜內(nèi)的電解質(zhì)外滲，細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大，因此電導(dǎo)率可反映細(xì)胞膜傷害的強(qiáng)度。以ED13為材料，甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，探討滲透壓對原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性的影響。酶解液CPW，附加2%PVP、0.2%BSA、3 mmol/L MES、0.3%纖維素酶、0.1%離析酶和不同濃度甘露醇，酶解12 h。結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，葉片25℃酶解12 h時，電導(dǎo)率隨著甘露醇濃度的提高先降后升，在甘露醇濃度為0.5 mol/L時，電導(dǎo)率最低，表明細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏最少，細(xì)胞受到的傷害最小。

2.2.2 酶解時間對原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性的影響

以ED13為材料，酶解液CPW，附加2%PVP、0.2%BSA、3 mmol/L MES、0.3%纖維素酶和0.1%離析酶，研究酶解時間對電導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明，與完整葉片相比，葉片切割后溶液中電導(dǎo)率增加，表明細(xì)胞破碎或受到傷害，電解質(zhì)外滲。隨著酶解時間的增加，電導(dǎo)率逐漸提高，表明酶解時間越長，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲的越多，細(xì)胞受到的傷害越大。因此在能獲得足夠數(shù)量的原生質(zhì)體前提下，酶解的時間越短越好。

CK1：完整葉片；CK2：葉片切條；1: 4 h；2: 8 h；3:12 h；4: 16 h；5: 20 h

2.2.3 基因型、酶濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

酶的種類和濃度是影響原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量的最主要因素。以ED13為材料，酶解液CPW，附加2%PVP、0.2%BSA、3 mmol/L MES以及不同濃度纖維素酶和離析酶，酶解葉片12 h，研究酶濃度對原生質(zhì)體分離的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，纖維素酶濃度過低(0.1%)，游離的單細(xì)胞少，且呈不規(guī)則形狀，表現(xiàn)為細(xì)胞壁不完全降解的特征；隨著纖維素酶濃度的提高，游離的單細(xì)胞增多，細(xì)胞呈圓球形；纖維素酶的濃度過高(1%)，細(xì)胞破碎現(xiàn)象較為嚴(yán)重，細(xì)胞碎片多。離析酶濃度低(0.01%)，葉片組織不能充分解離；隨著離析酶濃度的增加，葉片組織解離，游離的單細(xì)胞增多；離析酶濃度過高(0.5%)，葉肉細(xì)胞破碎，單細(xì)胞減少。

由于不同基因型葉片結(jié)構(gòu)存在差異，不同基因型酶解時所需的最佳酶濃度略有差異，分別設(shè)纖維素酶濃度為0.3%和0.4%，離析酶濃度0.05%和0.1%，觀察不同酶組合對不同基因型分離的效果，結(jié)果見表3。由表3可知，在不同的酶組合中不同基因型的分離效果有差異，ED13、HS66和DH405分離時所需的酶濃度較低，在0.3% Cellulase + 0.1% Macerozyme的酶組合中分離的效果較好；CE171和DH401分離所需的酶濃度較高，在0.4% Cellulase + 0.1% Macerozyme的酶組合中分離的效果較好。

表2 不同酶組合對葉肉原生質(zhì)體分離的影響

表3 不同基因型分離的效果

注：“+”表示原生質(zhì)體產(chǎn)量或活力低；“++”表示原生質(zhì)體產(chǎn)量或活力中等；“+++”表示原生質(zhì)體產(chǎn)量或活力高。

2.2.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生

分離純化的原生質(zhì)體調(diào)整密度5×105個/mL后，取600 μL加入到有6 mL VKM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，第2 d細(xì)胞開始膨大，逐漸變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞第1次分裂發(fā)生在培養(yǎng)后的3～5 d，第7 d將培養(yǎng)皿置于弱光下，并逐漸增加光強(qiáng)，培養(yǎng)7～10 d左右形成多細(xì)胞團(tuán)，2周后要及時用稀釋培養(yǎng)基進(jìn)行8～10倍的稀釋，否則細(xì)胞褐化死亡，可能由于細(xì)胞生長過快引起營養(yǎng)枯竭或毒副產(chǎn)物積累所致。培養(yǎng)物稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)3～4周，原生質(zhì)體形成大量肉眼可見的愈傷組織。將小愈傷轉(zhuǎn)移到愈傷組織生長培養(yǎng)基上，這些小愈傷在愈傷組織生長培養(yǎng)基上生長很快，約2周長成直徑約3～4 mm大小的愈傷組織，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽的生成。由于馬鈴薯愈傷組織芽誘導(dǎo)所需時間較長，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上每隔2周轉(zhuǎn)移1次。第1個芽發(fā)生在愈傷組織在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)2個月左右，當(dāng)芽長到0.5 cm以上時，可以將其切下，轉(zhuǎn)移到無激素固體MS培養(yǎng)基上生長，無根苗在無激素固體MS培養(yǎng)基上可以自行生根 。

不同基因型在培養(yǎng)中的反應(yīng)不同，存在著基因型差異(表4)。在VKM 培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～8周，ED13和DH401原生質(zhì)體能夠形成3～4 mm愈傷組織，轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上，8周后分化出具有芽和根的完整植株，但是分化率較低，183塊ED13愈傷組織只有39塊分化出芽，分化率只有21.3%，157塊DH401 愈傷組織只有27塊分化出芽，分化率只有17.2%；HS66和CE171原生質(zhì)體培養(yǎng)6～8周也能形成3～4 mm愈傷組織，但沒有分化出芽；DH405的原生質(zhì)體不分裂。

表4 不同基因型對原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

注：“+”表示有；“-”表示無。

A—葉片漂浮預(yù)處理；B—界面法純化原生質(zhì)體；C—純化的原生質(zhì)體；D—FDA檢測原生質(zhì)體活力。

3 討論

原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生體系的建立是原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用于育種實(shí)踐的前提。馬鈴薯原生質(zhì)培養(yǎng)中首先要保證分離的原生質(zhì)體有持續(xù)分裂的能力，其影響因素除培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法外，供體的基因型、供體的生理狀況、原生質(zhì)體活力等均可影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的成敗。

基因型是原生質(zhì)體培養(yǎng)的關(guān)鍵因子。曾有文獻(xiàn)報(bào)道油菜的再生能力以AABB 染色體組品種最強(qiáng)，AACC 次之，AA最差[9]。此外在苜蓿、生姜、葡萄、馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)時也發(fā)現(xiàn)在愈傷組織形成或再生上存在著基因型差異[10-12]。本試驗(yàn)中，馬鈴薯原生質(zhì)培養(yǎng)中也是有些基因型獲得了再生植株，DH405只分離到了活力強(qiáng)的原生質(zhì)體，但不能持續(xù)分裂，雖然CE171和HS66獲得了多細(xì)胞團(tuán)的小愈傷，但失去了再分化的能力。

A—原生質(zhì)體膨大；B—原生質(zhì)體第一次分裂；C—形成的多細(xì)胞團(tuán)；D—形成的小愈傷；E—愈傷組織分化出芽；F—原生質(zhì)體再生出完整植株。

酶解時間和酶解溫度對原生質(zhì)體活力有決定性的影響，研究表明隨著酶解時間增加，原生質(zhì)體破裂，原生質(zhì)體活力下降[13， 14]。我們的研究表明，總的趨勢是酶解時間短，原生質(zhì)體產(chǎn)量低；酶解時間長原生質(zhì)體破裂較多，原生質(zhì)體膜不穩(wěn)定，膜的滲透性增加，原生質(zhì)體活力降低甚至死亡，但是不同基因型最適酶濃度不同，需要在實(shí)踐中反復(fù)摸索。推測可能與供體植株生長環(huán)境、生理狀態(tài)以及葉片結(jié)構(gòu)組成差異有關(guān)。

酶解液和純化溶液中的滲透壓也影響原生質(zhì)體的活力。由于原生質(zhì)體本身穩(wěn)定性差的特性，很容易導(dǎo)致其破碎。因此原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)過程中，必須加入適當(dāng)濃度的滲透劑以維持一定的滲透壓，滲透壓過高或過低都會影響原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性，造成原生質(zhì)體凋亡或破裂。前人在分離馬鈴薯原生質(zhì)體時所用的酶液，使用0.4～0.6 mol/L的甘露醇維持滲透壓[15， 16]。我們研究結(jié)果表明，酶解液中滲透壓的過高或過低會造成電導(dǎo)率增加，當(dāng)酶解液含有0.5 mol/L甘露醇時，電導(dǎo)率最低，表明原生質(zhì)體膜的滲透性最小，受到的傷害最少。

本研究通過原生質(zhì)體分離純化條件的摸索，已獲得高產(chǎn)量、高活力原生質(zhì)體，并培養(yǎng)成試管苗，已建立馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，為馬鈴薯體細(xì)胞雜交奠定了基礎(chǔ)。

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