陸海波, 胡慧慧, 徐年軍, 孫 雪

(寧波大學 海洋學院 教育部應用海洋生物技術重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

隨著社會經濟的迅猛發(fā)展，在能源過度消耗的同時也間接地造成了許多環(huán)境問題，世界原油和天然氣儲量據推測分別在40年和64年后消耗完[3]。因此，進行新型能源研究具有長遠的意義。利用微藻生產生物能源具有可再生、可降解、同時吸收空氣中CO2等優(yōu)點，倍受人們的青睞[4]。但是微藻培養(yǎng)過程中要消耗大量的淡水，投入大量氮磷等營養(yǎng)成分[5]，這些導致的高培養(yǎng)成本占到生物柴油生產總成本的70%以上，是目前微藻培養(yǎng)領域的世界性難題[6]。

小球藻(Chlorella)是一種可工廠化培養(yǎng)的微藻，它不但可以去除水體中的氮磷等物質，還可以凈化水質，因為小球藻的快速生長需要消耗大量的氮磷等物質，用富含氮磷的水來大規(guī)模培養(yǎng)小球藻在很大程度上可以減少對淡水的消耗，減少培養(yǎng)基中無機鹽的用量等，從而減少培養(yǎng)成本。目前關于利用工業(yè)廢水養(yǎng)殖微藻的相關研究比較多，但利用微藻養(yǎng)殖清除水產品加工廢水的研究未見報道。本文研究了2種小球藻在魚糜加工廢水中的生長和油脂變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)

實驗中所用蛋白核小球藻(C.pyrenoidsa)F-9由本實驗室分離獲得；普通小球藻(C.vulgaris)HYS-2從中國科學院海洋研究所購買。魚糜加工廢水取自寧波飛日水產實業(yè)有限公司，為魚糜加工過程產生的廢水，未經過化學處理。目前該工藝產生的廢水主要是氮磷營養(yǎng)超標，其中硝氮濃度為9.65 mg/L, 氨氮濃度為40.22 mg/L，磷濃度為7.50 mg/L。對照組為f/2培養(yǎng)基[7]，其硝氮濃度為12.71 mg/L,磷濃度為1.21 mg/L，氨氮未添加。

實驗前先用f/2培養(yǎng)基對小球藻進行為期7 d的培養(yǎng)，分別接種到f/2培養(yǎng)基和魚糜加工廢水中。實驗在光照培養(yǎng)箱中進行，500 mL三角瓶自養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度25℃，光照強度60 μmol/s，光照比12 h∶12 h，整個實驗過程嚴格執(zhí)行無菌操作。為防止藻細胞附壁或下沉，每隔2 h搖瓶1次，實驗進行15 d，每2 d取藻液1次，離心收集藻體，測定水體中氮磷含量。

1.2 方法

1.2.1 生長速率測定

每次取50 mL藻液，8000 r/min離心并冷凍干燥后對離心管進行稱重，小球藻生長速率用離心管前后重量之差表示。

1.2.2總脂含量測定

總脂含量測定采用香草醛比色法[8]。取2 mg小球藻粉，加3 mL CHCl3∶CH3OH 2∶1(v/v)混合溶液進行抽提。之后加蒸餾水1 mL，劇烈振蕩后離心分層，下層氯仿層為總脂提取液。藻粉殘渣重提1次，合并2次提取液。取0.1 mL提取液加入0.5 mL濃硫酸，混合均勻，沸水浴10 min，冷卻，加入1.978 mg/mL香草醛磷酸試劑2.5 mL，均勻混合，反應2 h，測定OD528。

1.2.3 小球藻脂肪酸分析方法

脂肪酸提取參照文獻[9]。取藻粉5 mg放入密閉玻璃試管中，加入50 μL的19∶0內標(0.3 μg/mL)與1 mL飽和氫氧化鉀-甲醇溶液，充氮氣，75 ℃水浴皂化10 min。冷卻，隨即加入2 mL的鹽酸-甲醇溶液(1 mol/L)，使溶液體系pH值<2.0，混勻，75 ℃水浴10 min，冷卻，分別加入1 mL石油醚和蒸餾水，振蕩，8000 r/min離心5 min，上層石油醚經干燥后氮氣吹干，色譜純正己烷定容后上GC-MS進行分析(日本Shimadzu GC-MS QP2010)，色譜及MS條件參照文獻[10]。

1.2.4 氨氮、硝氮和磷酸鹽含量的測定

小球藻藻液離心，收集上清液，采用EasyChem全自動間斷化學分析儀(意大利Systea)進行氨氮、硝氮和磷酸鹽含量的測定。氨氮、硝氮和磷酸鹽含量分別采用酚鹽自動比色法、鎘柱還原自動比色法、抗壞血酸自動比色法進行測定，依照公式：Ei=(C0-Ci)/C0×100%(C0為起始濃度，Ci為最終濃度)計算水體中氨氮、硝氮和磷酸鹽的去除效率。

1.2.5 數據統計分析

采用SPSS18.0軟件對數據的差異顯著性進行分析，其中P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。所有實驗進行3個平行樣，采用Office 2003中的Excel軟件進行平均值和方差分析作圖。

2 結果與分析

2.1 魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基對2種小球藻細胞干重的影響

圖1 魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基對2種小球藻細胞干重的影響

由圖1可見，2種小球藻在魚糜加工廢水中的生長速率遠大于f/2培養(yǎng)基，差異極顯著(P<0.001)。F-9和HYS-2的相對生長速率分別為0.366和0.417，生物量積累達0.293 g/L和0.276 g/L。在f/2培養(yǎng)基中，2種小球藻的生長情況與工業(yè)廢水中相類似，但生物量大約為魚糜加工廢水中的0.4～0.6倍，到第15天時，生物量分別達到了0.122 g/L和0.17 g/L。2種小球藻在不同培養(yǎng)基中的生長速度也表現出較大的差異，F-9在魚糜加工廢水中相對生長速率比HYS-2大，但在f/2培養(yǎng)基中比HYS-2生長慢。

2.2 魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基對2種小球藻油脂積累的影響

由圖2可見，F-9在魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實驗中前5天由于小球藻生長速度較快，油脂含量呈下降趨勢，到第11天時油脂含量開始迅速上升，到第13天時油脂含量達到最大值，此時油脂含量分別占細胞干重的17.87%和20.05%。HYS-2的油脂變化規(guī)律，前5天與F-9相一致，到第5天時油脂含量開始增加，第7天時油脂積累速度加快，在第11天時達到最大值。HYS-2在魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中的油脂分別占小球藻細胞干重的28.49%和36.22%。小球藻HYS-2在魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中的油脂含量顯著高于F-9培養(yǎng)基(P<0.05)，且油脂含量在11 d達到最高。

圖2 魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基對小球藻F-9(a)和HYS-2(b)油脂積累的影響Fig 2 The effects of surimi processing wastewater and f/2 medium on the lipid accumulation of Chlorella of F-9(a) and HYS-2(b)

2.3 魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基對2種小球藻脂肪酸含量的影響

小球藻F-9和HYS-2在魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后的脂肪酸變化情況如表1所示。實驗結果表明，小球藻F-9在實驗第1天的總脂肪酸含量占干重的10.46%，其中主要是C16∶0、C18∶2和C18∶3 3種脂肪酸，含量為8.44%。培養(yǎng)15 d后，2種培養(yǎng)基中小球藻脂肪酸含量都呈下降態(tài)勢，其f/2培養(yǎng)基中脂肪酸含量下降幅度比較小，總脂肪酸含量占干重的8.04%，3種脂肪酸C16∶0、C18∶2和C18∶3的含量也降低不少，從第1天的4.38%、1.90%和2.16%分別下降到2.80%、1.41%和1.27%，不過增加了脂肪酸C16∶3，含量為0.92%。魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中小球藻脂肪酸變化趨勢大致相同，只不過小球藻在魚糜加工廢水中增加了C16∶1和C16∶3 2種脂肪酸，其含量分別達到了0.14%和0.75%。

小球藻HYS-2在培養(yǎng)15 d后脂肪酸含量也發(fā)生了較大變化。在魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中，脂肪酸總量由第1天的16.24%分別下降至9.03%和14.18%。脂肪酸類型主要由C16∶0、C16∶1、C18∶1和C20∶5，其中C20∶5含量分別由第1天的1.70%上升至2.42%和2.28%。脂肪酸是總脂質量的重要指標，2種小球藻中總脂肪酸含量雖然不同，但在培養(yǎng)過程中均有下降，在魚糜加工廢水中下降幅度較大，可能是由于小球藻處于旺盛生長期，脂肪酸含量下降。

表1魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中2種小球藻的脂肪酸含量(細胞干重%)Table 1 The fatty acid composition of two species of Chlorella in surimi processing wastewater and f/2 medium(dry weight%)

2.4 2種小球藻對氮磷的去除作用

圖3 2種小球藻對魚糜加工廢水和f/2培養(yǎng)基中和的去除作用Fig 3 The removal effect of (a) and (b) in surimi processing wastewater and f/2 medium by two species of Chlorella

圖4 2種小球藻對魚糜加工廢水(a)和f/2培養(yǎng)基(b)中的去除效果Fig 4 The effect of two species of Chlorella on the removal in surimi processing wastewater(a)and f/2 medium(b)

3 討論

水資源和能源問題是兩個重要的社會環(huán)境經濟問題，地球水資源的短缺和富營養(yǎng)化是制約人類社會發(fā)展的一大瓶頸，污水再利用已成為當今世界研究的熱點。許多工業(yè)廢水均含有大量的氮、磷元素，可以滿足微藻培養(yǎng)過程中所需要的營養(yǎng)[11]。所以利用工業(yè)廢水進行微藻培養(yǎng)可以有效地解決培養(yǎng)成本過高的問題。

研究表明，工業(yè)廢水是一種很好的微藻替代培養(yǎng)基。Cho等[12]用市政污水處理廠的廢水進行微藻培養(yǎng)，結果利用厭氧消化罐AD:污泥濃縮罐和脫水設施CR (10∶90，v/v)組合廢水可以得到最高的生物量(3.01 g/L)，是BG-11培養(yǎng)基的1.72倍，同時用初級沉淀池出水(PS)培養(yǎng)細胞易于從培養(yǎng)物中分離，且可以提高細胞的油酸等油脂含量。周連寧等[13]發(fā)現豆制品廢水很適合小球藻的培養(yǎng)，在利用豆制品廢水進行小球藻培養(yǎng)過程中，只需適量添加鎂、氮和磷元素。不同來源的工業(yè)廢水其成分不同，有的含有大量的有機質，微藻可以進行兼性生長，而不同處理階段的工業(yè)廢水的成分也不同。本實驗中魚糜工業(yè)廢水是工廠通過簡單的物理方法處理的污水，主要是氮磷等營養(yǎng)成分超標。

微藻在工業(yè)廢水中養(yǎng)殖具有較高的生長速率和細胞濃度。Yang等[14]利用木薯制乙醇的廢水培養(yǎng)蛋白核小球藻，培養(yǎng)末期，細胞干重達到了3.73 g/L。Zhou等[15]用濃縮市政廢水培養(yǎng)經過兼性異養(yǎng)微藻，結果這些藻株有最高生長率(0.455～0.498/d)和油脂產率(74.5～77.8 mg/L·d)。曲春波等[16]用啤酒廢水對小球藻進行異養(yǎng)培養(yǎng)，結果利用由廢水配制含10 g/L葡萄糖的基本培養(yǎng)液培養(yǎng)蛋白核小球藻15-2070獲得了5.3 g/L藻細胞。呂素娟等[17]在氣泡柱式光反應器中培養(yǎng)柵藻，結果在優(yōu)化的生活廢水培養(yǎng)基(僅補充無機氮、磷、檸檬酸鐵銨以及微量元素)中微藻細胞濃度可達8.0 g/L左右，遠高于BG-11培養(yǎng)基5.0 g/L的水平。本實驗中直接利用魚糜加工排放的工業(yè)廢水養(yǎng)殖2種小球藻，結果發(fā)現，小球藻在未添加其它營養(yǎng)源的廢水中比在f/2培養(yǎng)基中生長快，而且生物量分別達到了0.293 g/L和0.276 g/L，并且是f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的2.4倍和1.6倍，但比文獻中報告的添加其它營養(yǎng)液、或兼性培養(yǎng)條件下的最終細胞濃度低。分析其可能原因是工業(yè)廢水中氮磷營養(yǎng)比較豐富，但營養(yǎng)不均衡，特別是缺乏微量元素等。

微藻在工業(yè)廢水中養(yǎng)殖具有較快的生長和油脂積累。Woertz等[18]發(fā)現在奶制品廢水中，廢水濃度的不同影響著微藻的含油量(14～29%)，其中最大生產量可達到17 mg/(L·d)。Kothari等[19]用乳制品廢水對衣藻Chlamydomonaspolypyrenoideum進行培養(yǎng)，結果乳制品廢水比BG-11培養(yǎng)基更適合微藻生長，在乳制品廢水中培養(yǎng)到第10天和第15天的微藻油脂含量分別為1.6 g和1.2 g，而BG-11培養(yǎng)基中微藻油脂含量分別為1.27 g和1.0 g，其對廢水中的硝氮、氨氮和磷的去除率分別為90%，74%和70%。Farooq等[20]發(fā)現在單一的光合自養(yǎng)條件下，野生型小球藻的最大生物量和油脂含量分別是1.5 g/L和18%，而通過光合自養(yǎng)和光合異養(yǎng)這兩個階段，生物量可增加到了3.5 g/L，油脂生產力從31.1 mg/(L·d)增加到了108.0 mg/(L·d)。曹海等[21]發(fā)現在未經處理的啤酒廢水中添加KNO3、MgSO4和Na2HPO4，調整pH值至8.0的改良培養(yǎng)基更加適于培養(yǎng)小球藻，在此培養(yǎng)基中小球藻細胞濃度達0.948 g/L，為對照組的2.69倍；油脂產率達11.84 mg/(L·d)，為對照組的1.97倍。劉建強等[22]用市政污水培養(yǎng)普通小球藻，結果小球藻的生長率在培養(yǎng)8 d后達到最大,OD680為2.856，日均最大積累速率為0.01 g/L,油脂含量為干質量的18%,油脂的平均日產量為0.001 g/L。本實驗中小球藻HYS-2在工業(yè)廢水中油脂含量最高可達36.22%，為f/2培養(yǎng)基中的1.27倍，F-9在工業(yè)廢水中的油脂含量為17.89%，為f/2培養(yǎng)基中的0.89倍。說明不同藻種對工業(yè)廢水的利用有一定的差異，魚糜工業(yè)廢水有利于小球藻HYS-2中的油脂積累。

微藻的生長可以消耗大量的氮、磷元素，并能移除重金屬物質，以及一些有毒有機化合物，不會導致二次污染[22]。利用微藻培養(yǎng)進行工業(yè)廢水處理也凸顯其經濟價值，然而，利用微藻產油并凈化廢水需要解決幾個核心問題：1)藻種篩選，目標藻種必須在廢水中生長速度快、油脂產量高，同時又能起到凈化廢水的效果，因此，需要通過現代生物技術開發(fā)出符合要求的“工程微藻”；2)微藻光生物反應器的開發(fā)與設計，綜合考慮微藻生長的光照、pH值、溫度等要素，研發(fā)高效、低成本、可規(guī)?；\轉的光合生物反應器；3)開發(fā)微藻廢水處理與生物質能源生產耦合系統，在該系統中，藻細胞的采收是其生物質得以利用及保證廢水處理廠出水水質的基礎[24]。

本實驗中2種小球藻在自養(yǎng)條件下對魚糜加工廢水中氮、磷營養(yǎng)鹽的去除效果十分顯著，可以快速將魚糜加工廢水處理至排放標準。同時，本實驗是首次用小球藻培養(yǎng)處理水產品加工工業(yè)廢水，結果用未經任何化學處理的魚糜加工廢水養(yǎng)殖小球藻在綜合生長速率上遠遠大于f/2培養(yǎng)基，說明其具有較好地發(fā)展?jié)摿Γ梢詫崿F微藻的低成本養(yǎng)殖。

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