余娜，鐘志勇，唐小江,#，劉圣蘭, 劉培慶，蔣建敏,*

1. 中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣州510006 2. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣州528248

鎘是人體一種非必需的二價(jià)金屬離子，鎘可以通過呼吸道、消化道進(jìn)入人體，并且在體內(nèi)多種器官(例如腎臟、肝臟及肺)長期蓄積引起嚴(yán)重的毒性作用。職業(yè)接觸和環(huán)境污染引起的鎘超標(biāo)、中毒已經(jīng)被廣泛報(bào)道[1]。由于鎘具有較長的生物半衰期(10-30年)，長期暴露于低濃度的鎘污染環(huán)境會導(dǎo)致機(jī)體特別是腎臟嚴(yán)重的鎘蓄積[2]。腎近端小管的S1及S2段是鎘毒性的作用靶點(diǎn)，并會引起腎衰[3]。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，鎘在腎小管細(xì)胞蓄積后，由于金屬硫蛋白(MT)的耗竭，引起鎘自由基作用，對線粒體等導(dǎo)致?lián)p傷從而引起腎小管細(xì)胞的凋亡或壞死。然而，鎘引起腎毒性的細(xì)胞凋亡機(jī)制的決定因素仍然是不詳。

壞死和凋亡是細(xì)胞死亡的兩種主要形式，多種毒性化合物能根據(jù)細(xì)胞類型的不同來誘導(dǎo)不同細(xì)胞的凋亡。凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、免疫反應(yīng)及清除廢棄物和異常細(xì)胞過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。凋亡紊亂可破壞組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)及其功能，凋亡紊亂也和多種疾病例如癌癥、神經(jīng)退行性病變以及毒素誘導(dǎo)疾病相關(guān)。鎘能夠引起多種組織及細(xì)胞的凋亡，包括大鼠肝臟、腎臟及睪丸[5,6]，人T細(xì)胞系CEM-C12，淋巴瘤細(xì)胞U937，正常肝細(xì)胞，肝細(xì)胞L-02，人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5，前列腺上皮細(xì)胞，大鼠間質(zhì)細(xì)胞，鼠肺上皮細(xì)胞，皮質(zhì)神經(jīng)元及腎小管上皮細(xì)胞和豬腎細(xì)胞LLC-PK1[7-10]。這些研究表明通過凋亡通路引起腎近端小管上皮細(xì)胞的死亡是鎘致腎毒性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本文將概述以往鎘引起腎細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展及其發(fā)現(xiàn)來討論鎘通過細(xì)胞凋亡通路引起腎臟毒性的作用機(jī)制。

1 線粒體介導(dǎo)的凋亡通路

Caspase在促發(fā)及執(zhí)行凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而caspase 可通過線粒體通路以及死亡受體通路來激活。內(nèi)在的線粒體通路可被多種刺激因素包括活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及細(xì)胞內(nèi)鈣而激活，而線粒體釋放的凋亡前因子細(xì)胞色素C(Cyt c)，它能夠激活caspase-9和caspase-3 從而誘導(dǎo)凋亡。在腎近端小管上皮細(xì)胞，鎘能誘導(dǎo)激活caspase-9和caspase-3，這提示了鎘致腎毒性可能與線粒體及caspase介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)[10]。

而在大鼠腎近端小管細(xì)胞WKPT-0293 Cl.2和鼠腎系膜細(xì)胞中，鎘能促進(jìn)凋亡前因子的釋放，例如線粒體內(nèi)核酸內(nèi)切酶凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)，這表明鎘除了能激活caspase依賴性的凋亡通路外，也能夠誘導(dǎo)caspase非依賴性的通路來破壞線粒體功能[10,11]。而且，在人胚腎細(xì)胞HEK-293的實(shí)驗(yàn)中，將線粒體從腎細(xì)胞分離后處理發(fā)現(xiàn)鎘能夠通過增加線粒體膜的通透性及降低線粒體膜電位來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12]。早在2003年Danial實(shí)驗(yàn)結(jié)果就已證明，線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(permeability transition pore, PTP)開放是導(dǎo)致Cyt c釋放的直接原因。PTP與線粒體膜電位的穩(wěn)定密切相關(guān)。PTP的周期性開放能夠維持線粒體內(nèi)電化學(xué)平衡及穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)PTP持續(xù)性開放時(shí)就會導(dǎo)致線粒體膜電位降低甚至是完全崩解，而線粒體膜電位的崩解是細(xì)胞凋亡的特異性早期指標(biāo)之一。而一旦線粒體膜電位耗散，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣釋放

鈣離子是細(xì)胞內(nèi)第二信使，調(diào)控多種細(xì)胞生理過程，包括細(xì)胞的增殖、分化及死亡和生長。鎘能使腎小管細(xì)胞中的鈣離子濃度升高[13]。盡管鎘誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的機(jī)制尚不十分清楚，此機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)釋放鈣離子以及鈣吸收有關(guān)。而細(xì)胞內(nèi)鈣增高會通過calpain-caspase 通路來促發(fā)腎小管細(xì)胞的凋亡[14,15]。

磷脂酶C(phospholipase C, PLC)可將磷脂酰肌醇4，5-二磷酸變成肌醇-1,4,5,-三磷酸(inositol-1,4,5-triphosphate, IP3)，并通過與IP3受體相作用來誘導(dǎo)鈣離子從ER中釋放[16]。最近，在人胚腎細(xì)胞HEK-293的實(shí)驗(yàn)中闡述了PLC-鈣依賴性通路在鎘誘導(dǎo)凋亡過程中的可能作用，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用PLC特異性抑制劑U73122能夠抑制鎘引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增高以及鎘誘導(dǎo)鈣蛋白酶calpain 和 caspase-3的激活[17]。而且，在腎遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞A6中，發(fā)現(xiàn)鎘能激活細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor, GPCR)，而GPCR又能夠激活PLC，并且通過激活PLC來增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[18]。這些研究表明GPCR介導(dǎo)的PLC激活可能是鎘誘導(dǎo)腎近端小管細(xì)胞中的ER釋放鈣離子的通路之一。然而，鎘誘導(dǎo)的凋亡并不完全能被U73122所抑制[17]，這提示鎘也可能通過PLC非依賴性通路來誘導(dǎo)凋亡。

鞘脂類神經(jīng)酰胺(ceramide)在多種細(xì)胞生理過程(包括多種組織的細(xì)胞死亡及生存)發(fā)揮著重要的作用[19]。神經(jīng)酰胺在鎘通過calpain-caspase 通路來誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著一種第二信使的作用[14,20-22]。在大鼠腎近端小管細(xì)胞WKPT-0293 C1.2中，用外源性C6-神經(jīng)酰胺作用后可增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以及激活calpain 和 caspase-3[21]。而且，使用神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑來阻斷神經(jīng)酰胺的重新合成，從而可抑制由急性鎘中毒所引起的calpain的激活以及細(xì)胞的凋亡[20,21]。這些研究發(fā)現(xiàn)說明了鎘能夠引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，而鈣離子水平的增高可通過增加神經(jīng)酰胺的合成來激活calpain 和caspase。而且，由于ER的鈣耗竭可能與ER應(yīng)激相關(guān)，故有可能是鎘誘導(dǎo)ER的鈣離子釋放，從而不僅誘導(dǎo)了calpain-caspase 通路而且也激活了ER應(yīng)激的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)[23]介導(dǎo)的凋亡通路。體外的研究結(jié)果需要進(jìn)一步通過體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)，從而更好地了解鎘致腎毒性的機(jī)制。然而，當(dāng)前不存在有關(guān)腎近端小管細(xì)胞通過神經(jīng)酰胺-calpain通路介導(dǎo)凋亡的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的未折疊蛋白反應(yīng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激參與了細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[23]。在多種病理生理?xiàng)l件下，例如缺氧、局部缺血、病毒感染及神經(jīng)退行性病變都可能造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的蓄積并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激又會誘導(dǎo)稱為UPR的協(xié)調(diào)自適應(yīng)程序反應(yīng)[23,24]。UPR可通過上調(diào)伴侶蛋白的表達(dá)，抑制總蛋白的翻譯來增強(qiáng)蛋白折疊能力從而來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，而通過泛素化蛋白酶體系來激活ER相關(guān)的降解反應(yīng)可促進(jìn)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的降解。然而，當(dāng)UPR不能夠拯救細(xì)胞的時(shí)候，ER應(yīng)激就會誘導(dǎo)凋亡。

在豬腎近曲小管上皮細(xì)胞LLC-PK1中已表明鎘能通過ER應(yīng)激來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25,26]。ER中感應(yīng)ER應(yīng)激的最主要感受器是：RNA依賴性蛋白激酶樣ER激酶(protein kinase-like ER kinase, PERK),活性轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和需肌醇的ER-to-nucleus 信號激酶1(inositol-requiring ER-to-nucleus signal kinase 1, IRE1)。在三個(gè)通路中，ATF6及IRE1可分別通過誘導(dǎo)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白質(zhì)(CCAAT/enhancer binding protein-homologous protein, CHOP)以及通過激活X-box結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)和磷酸化碳末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25,26]。有體外的研究表明鎘能通過ER應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路來引起腎毒性。然而，在小鼠體內(nèi)，長期低劑量的鎘處理后是否會通過ER應(yīng)激來引起腎上皮細(xì)胞的凋亡，對于該問題仍是不詳。由于鎘慢性毒性的主要靶器官是腎臟，我們需要做進(jìn)一步的體內(nèi)研究來確定ER應(yīng)激通路在鎘誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞凋亡及腎毒性過程中的重要性。

在豬腎細(xì)胞LLC-PK1中，鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)；在人胚腎細(xì)胞HEK-293實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鎘能夠抑制乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性，并增強(qiáng)活性氧(ROS)及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12]。這表明氧化應(yīng)激有可能是慢性鎘中毒后引起腎毒性的機(jī)制之一，但是鎘誘導(dǎo)腎臟的氧化應(yīng)激機(jī)制尚未清楚[27]?？寡趸瘎┖统趸锲缁傅倪^表達(dá)都可緩解由鎘引起的可激活凋亡的UPR信號級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的ER應(yīng)激反應(yīng)[26]。雖然我們不知道ROS在腎臟中是如何誘導(dǎo)ER應(yīng)激的，但鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可能與鎘通過ER應(yīng)激而引起的腎細(xì)胞凋亡有關(guān)。

3 p53介導(dǎo)的凋亡通路

為明確鎘致腎毒性的分子機(jī)制及分子靶點(diǎn)，最近有研究通過DNA微陣列芯片的方法來檢測鎘刺激后的正常大鼠腎上皮細(xì)胞(normal rat kidney epithelial cells，NRK-52E)的基因表達(dá)類型[28]。發(fā)現(xiàn)鎘在引起細(xì)胞毒性前能夠增加NRK-52E細(xì)胞73基因的表達(dá)以及降低42基因的表達(dá)。在這些基因當(dāng)中，我們關(guān)注與泛素化蛋白酶體系相關(guān)的Ube2d4基因，研究發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞中Ubc4(Ube2d的同源家族)的表達(dá)水平會影響細(xì)胞對鎘毒性的敏感性[29]。泛素化蛋白酶體系是一種降解損傷或短壽命蛋白的途徑[30,31]。機(jī)體非必需蛋白質(zhì)通過泛素化激活酶(E1)，泛素化結(jié)合酶(E2)，泛素化連接酶(E3)，以及泛素化鏈延長因子(E4)而被泛素化，而后這些被泛素化的蛋白又可被蛋白酶降解。Ube2d4是Ube2d家族的成員之一，負(fù)責(zé)編碼泛素化結(jié)合酶E2D4(Ube2d)。在NRK-52E細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)鎘不僅能明顯快速地抑制Ube2d4的基因表達(dá)，而且能有效地抑制其他的Ube2d基因家族，包括Ube2d1、Ube2d2以及Ube2d3的基因表達(dá)[32]。鎘可通過非選擇性地明顯下調(diào)Ube2d基因來抑制Ube2d家族酶介導(dǎo)的非必需蛋白質(zhì)的降解，從而可導(dǎo)致這些非必需蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。

在人乳腺癌細(xì)胞MCF7中，已證明Ube2d2和Ube2d3與腫瘤抑制蛋白p53的降解和泛素化有關(guān)[30]。p53是一種腫瘤抑制基因，它對細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)起著重要的調(diào)控作用[31,32]。眾所周知，p53可立即被泛素化蛋白酶體系所降解以及被泛素化，而p53的數(shù)量可通過降解率而非合成率來被穩(wěn)定調(diào)控[30-32]。在NRK-52E細(xì)胞中的研究表明鎘能顯著地增加p53在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，并伴隨著p53的磷酸化作用，在細(xì)胞出現(xiàn)凋亡前鎘既沒有上調(diào)p53的基因表達(dá)也沒有直接抑制蛋白酶的活性[32]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鎘可通過下調(diào)Ube2d基因家族來抑制泛素化蛋白酶體系中的p53的降解從而引起p53的過度蓄積，因此鎘就能誘導(dǎo)p53依賴性的細(xì)胞凋亡。

而且，在用鎘長期處理小鼠腎臟12個(gè)月后發(fā)現(xiàn)鎘能抑制所有Ube2d基因(Ube2d1，Ube2d2，Ube2d3)的表達(dá)，而這將會導(dǎo)致中度的腎毒性。經(jīng)鎘處理后，在腎臟中可觀察到p53蛋白的表達(dá)水平增高，但是p53的mRNA水平不變。而經(jīng)鎘處理12個(gè)月后的小鼠腎臟中發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞會損傷腎小管細(xì)胞，但不會損傷腎小球。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)鎘處理12個(gè)月后，在小鼠的腎小管細(xì)胞以及NRK-52E細(xì)胞中，鎘會通過抑制Ube2d基因家族的表達(dá)來引起p53的過度蓄積，從而鎘能誘導(dǎo)p53依賴性的腎小管細(xì)胞凋亡[32]。最近siRNA干擾p53的研究也表明鎘可誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的凋亡通路[33]，在大鼠上皮細(xì)胞及人前列腺上皮細(xì)胞中[9]將p53進(jìn)行siRNA干擾后可抑制鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且，在多種細(xì)胞中，鎘可引起細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平及p53蛋白磷酸化水平的增加[34-36]。這些研究也同樣表明了，經(jīng)鎘長期刺激腎近端小管細(xì)胞后，p53通路是誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路之一。

4 總結(jié)與展望

由于腎臟及腎細(xì)胞是慢性鎘中毒的主要靶器官及靶組織，因此在本綜述中，我們重點(diǎn)闡述了有關(guān)鎘引起腎臟及腎細(xì)胞凋亡的通路，鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路主要?dú)w納為三個(gè)：1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路，可分為由ER應(yīng)激誘導(dǎo)的UPR的細(xì)胞凋亡以及由ER鈣釋放而激活的calpain-caspase凋亡通路；2)直接或間接的激活線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性或caspase非依賴性凋亡通路；3)通過抑制Ube2d基因家族的表達(dá)以及促進(jìn)p53的過度蓄積而引起的p53凋亡通路(Fig.1)。雖然也包括其他的通路及因素，但這三條通路在鎘誘導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著決定性的作用。然而，與鎘直接作用的靶分子以及每個(gè)通路在鎘誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡中的重要程度仍然不是十分清楚。而且，有關(guān)鎘在人體腎細(xì)胞中的凋亡效應(yīng)及作用機(jī)制也是知之甚少。但是，最近在人腎近端小管細(xì)胞HK-2的實(shí)驗(yàn)研究中報(bào)道，ER應(yīng)激抑制劑salubrinal可通過阻斷細(xì)胞死亡信號通路來抑制鎘誘導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡[37]。

圖1 鎘引起腎毒性的3個(gè)主要凋亡通路。 1) 線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性/caspase非依賴性的凋亡通路；2) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路，包括URP依賴性和calpain-caspase依賴性的凋亡通路；3) p53依賴性凋亡通路，通過抑制Ube2d基因的表達(dá)從而導(dǎo)致p53的蓄積而引起細(xì)胞凋亡。Cd：鎘；Apoptosis：細(xì)胞凋亡。Fig. 1 Model for three cadmium-induced apoptosis pathways in the kidney cadmium induces three major apoptotic pathways in the kidney cells as follows: 1) the mitochondria-mediated pathway via direct and indirect activation of mitochondria by cadmium, followed by caspase-dependent and/or-independent pathways; 2) the ER-mediated pathway via ER stress and calcium release that is followed by the activation of UPR-dependent and calpain-caspase-dependent apoptotic pathways, respectively; 3) the p53-dependent apoptotic pathway via suppression of the Ube2d gene family expression and p53 overaccumulation.

綜上所述，可知細(xì)胞凋亡可能在鎘致腎毒性的過程中發(fā)揮著重要的作用。鎘致腎毒性的細(xì)胞凋亡機(jī)制闡明對研究鎘腎毒性的發(fā)生發(fā)展提供了一個(gè)新視覺。今后，我們也需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究去確定每個(gè)凋亡通路的影響程度以及治療鎘致腎毒性的關(guān)鍵靶分子。

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