張蕓香,劉晶晶,白晉華,郭紅彥,郭晉平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,山西太谷 030801)

文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge.)屬無患子科文冠果屬，落葉喬木和灌木，廣泛分布于我國北方荒山坡地、溝谷間和丘陵地帶，有較強的適應(yīng)性和抗逆能力，根系發(fā)達、根蘗能力強，是優(yōu)良的水土保持樹種、園林綠化樹種、蜜源植物和生物質(zhì)能源樹種[1，2]。

文冠果人工栽培的時間并不長，目前仍處于野生和半野生的狀態(tài)。在長期的自然雜交下，文冠果群體內(nèi)形成了許多類型，具有豐富的遺傳多樣性；產(chǎn)量良莠不齊，卻存在著豐產(chǎn)性能好的優(yōu)良單株[3，4]。因此，選擇優(yōu)良單株進行無性繁育，對優(yōu)良單株進行無性系鑒定，找出經(jīng)濟性狀(豐產(chǎn)性能)優(yōu)異的無性系，培育出豐產(chǎn)性能好的品系(或品種)是當(dāng)前非常迫切和艱巨的一項任務(wù)。

簡單重復(fù)序列間擴增(Inter-Simplie Sequence Repeat，ISSR-PCR)是近年來在微衛(wèi)星技術(shù)上發(fā)展起來的一類新型的分子標記技術(shù)[5]，具有多態(tài)性高，穩(wěn)定性好，不需預(yù)知基因序列，檢測速度快，產(chǎn)物特異性強，DNA用量少，技術(shù)要求低，技術(shù)成本低等特點[6]。現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)進化、基因定位、遺傳圖譜等方面的研究[7～11]。由于ISSR分子標記技術(shù)基于聚合酶鏈式反應(yīng)Polymerase Chain Reaction，PCR[12]，其反應(yīng)條件受模板DNA濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、退火溫度等多個因素的影響。為保證結(jié)果的清晰、可靠和準確，減少實驗的盲目性，必須對這些因素進行優(yōu)化，構(gòu)建特異性反應(yīng)體系。為此，本研究采用均勻設(shè)計，對影響文冠果ISSR-PCR反應(yīng)的引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTP濃度等4個主要因素在5個水平上進行優(yōu)化試驗，建立文冠果ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，為今后PCR反應(yīng)體系優(yōu)化方法的選擇提供參考。通過對文冠果基因組DNA的PCR擴增，淘汰無擴增帶和擴增后條帶不理想的引物，從中選取多態(tài)性高，條帶清晰、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的引物作為文冠果ISSR分析引物，同時結(jié)合對擴增反應(yīng)循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化，獲得文冠果ISSR-PCR反應(yīng)的最佳擴增程序，為文冠果種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及系統(tǒng)保護提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以文冠果實生苗幼葉為試驗材料。種子采自山西省襄汾縣苗圃，經(jīng)冬季低溫沙藏處理，春季種于花盆中，長出真葉后，用已滅菌剪刀剪取嫩葉，稱取所需質(zhì)量，用去離子水沖洗干凈后，立即用于試驗。

1.2 主要試劑及儀器

試驗所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物序列，由北京奧科生物工程公司合成。TaqDNA聚合酶、Mg2+和 dNTP購自天根生化科技有限公司。Marker采用BM 2000，購自天根生化科技有限公司。PCR反應(yīng)在Biometra T1型PCR循環(huán)儀上進行。

1.3 基因組DNA提取

文冠果基因組DNA提取采用改良CTAB法[13]，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。稀釋10倍后待用。

1.3.1 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計及PCR擴增

選用20 μL體系，模板1 μL，2×PCR buffer，UBC815為引物，針對影響PCR反應(yīng)的引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTP濃度4個因素，采用兩輪均勻設(shè)計，對文冠果ISSR-PCR體系進行優(yōu)化[14]。首先選用U20(54)均勻設(shè)計表，參加PCR反應(yīng)的因素水平見表1，U20(54)均勻設(shè)計方案見表2。對第一輪試驗結(jié)果進行分析，初步篩選出優(yōu)化組合，并以此作為第2輪均勻設(shè)計的依據(jù)。第2輪均勻設(shè)計的因素和水平見表3，選用均勻設(shè)計表U12(34)進行試驗(表4)。

表1 第一輪均勻設(shè)計因素與水平

表2 均勻設(shè)計U20(54)表

表3 第2輪均勻設(shè)計因素和水平

表4 均勻設(shè)計U12(34)表

1.3.2 ISSR-PCR 擴增程序優(yōu)化

以第2輪均勻設(shè)計優(yōu)化的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對文冠果ISSR-PCR擴增程序中的循環(huán)次數(shù)進行篩選優(yōu)化。擴增程序采用TaqDNA聚合酶推薦擴增程序，94℃預(yù)變性5 min，接著進行循環(huán)：94℃變性35 s，52～56℃退火35 s，72℃延伸45 s；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min。循環(huán)次數(shù)設(shè)35、40、45 3個梯度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR體系的均勻優(yōu)化

第一輪4因素5水平均勻設(shè)計共20個處理組合的ISSR-PCR體系的擴增結(jié)果見圖1。

圖1 第一輪均勻設(shè)計實驗結(jié)果Fig.1 Amplification results of the initial uniform design注：M BM2000 Marker ；1～20 分別為表2中1～20處理。Note:M BM2000 Marker ；1～20 amplification results of treatment 1～20 in table 2.

從圖1可見，不同水平組合的ISSR-PCR體系，擴增結(jié)果有差異。組合5、6、11、14、16沒有擴增，組合1、2、19擴增帶譜彌散，難以區(qū)分；組合4、7、8、10、20擴增帶譜弱，擴增帶少；組合3、9、13、15、18帶譜模糊，有拖帶現(xiàn)象，辨識困難，依稀可見帶譜較多；組合12、17帶譜明顯，但有輕微拖帶現(xiàn)象。結(jié)合擴增帶譜的數(shù)目、強弱、清晰度等指標，組合12和17效果相對較好。為獲得理想的ISSR-PCR體系，根據(jù)組合12和17對應(yīng)的因素水平上，分別設(shè)計3水平(表3)，進行第二輪均勻設(shè)計篩選(表4)，擴增結(jié)果見圖2。

由圖2可見，12個組合中，組合3、4、9擴增帶少且弱，效果差；組合1擴增帶少，亮度大，條帶不清晰；2、6、7、8、12擴增帶少，亮度大，條帶清晰；組合11擴增帶多，亮度大，條帶不清晰；組合5、10擴增帶多，亮度大，條帶清晰，效果較好。組合5(20 μL反應(yīng)體系中，含dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和0.4 UTaqDNA聚合酶)擴增條帶多，帶譜清晰，易分辨，被確定為第二輪均勻設(shè)計篩選結(jié)果。

2.2 循環(huán)次數(shù)對ISSR-PCR體系的影響

循環(huán)數(shù)是影響ISSR-PCR體系的重要因素，它決定了整個PCR反應(yīng)的產(chǎn)量：循環(huán)數(shù)太少，PCR產(chǎn)物的量就低；循環(huán)數(shù)目多，產(chǎn)物相應(yīng)地增加。理論上說，循環(huán)數(shù)越多，產(chǎn)物量越大，但實際到了反應(yīng)平臺期后，PCR產(chǎn)物不會有明顯增加，反而引起非特異性擴增甚至無擴增[14]。

圖2 第2輪均勻設(shè)計試驗結(jié)果Fig.2 Amplification results of the secondary uniform design注：M BM2000 Marker ；1～12 分別為表4中1～12處理。Note:M BM2000 Marker ；1～12 amplification results of treatment 1～12 in table 4.

圖3中，1～3分別為45、40和35次循環(huán)的ISSR-PCR擴增結(jié)果。由圖3可見，循環(huán)次數(shù)為35次時，擴增帶較弱，隨著循環(huán)次數(shù)增加，擴增帶亮度增加，即帶譜由弱變強，表示擴增產(chǎn)物增加。循環(huán)次數(shù)為45次時，出現(xiàn)涂抹現(xiàn)象，擴增帶減少，40個循環(huán)對于文冠果的ISSR-PCR擴增效果最好。

圖3 不同循環(huán)次數(shù)ISSR-PCR擴增結(jié)果Fig.3 Amplification results of ISSR-PCR with different cycles注：M BM2000 Marker；1～3 分別表示循環(huán)次數(shù)為45,40,35。Note: M BM2000 Marker ；1～3 means 45 cycles，40 cycles，35 cycles，respectively.

3 討論與結(jié)論

ISSR-PCR反應(yīng)對模板濃度的要求范圍較寬。馮富娟等在進行紅松ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化時證實模板純度不會影響擴增結(jié)果，模板濃度在10～200 ng·μL-1之間擴增結(jié)果相同[6]。因此，本試驗在進行優(yōu)化時沒有考慮模板純度和濃度對反應(yīng)體系的影響，而是將提取的模板DNA稀釋10倍后取1μL后進行PCR擴增，取得了良好的擴增效果。

在PCR反應(yīng)中，退火溫度直接決定引物與模板DNA的特異性結(jié)合，不同的物種和引物有不同的退火溫度，退火溫度過低，引物與模板的結(jié)合性差，退火溫度過高，非特異性擴增增加[15]。為此，使用不同引物時要對退火溫度進行篩選，一般以引物的退火溫度為標準±5 ℃，在此范圍內(nèi)，每2 ℃為一個梯度，進行退火梯度試驗，得出試驗所用引物的最佳退火溫度，然后進行試驗。

本試驗采用U20(54)和U12(34)均勻設(shè)計表，對影響文冠果ISSR-PCR的4個主要因素進行篩選，得出在20μL體系中，四因素的最佳濃度分別為：dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1、Mg2+2.5 mmol·L-1和TaqDNA聚合酶0.4 U。循環(huán)數(shù)為40時擴增效果最好。

參 考 文 獻

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