齊仙惠，李改珍，巫東堂

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，山西 太原 030031)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)又叫石刁柏，多年生雌雄異株草本植物，營養(yǎng)豐富，藥食同源[1]，是世界十大名菜之一[2]。近年來，隨著人們對飲食健康的關(guān)注，蘆筍這一保健蔬菜備受青睞，需求量也隨之增長[3]。為確保蘆筍產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，應(yīng)加大育種研究的力度。

近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物育種研究中的應(yīng)用越來越廣泛，涉及植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等諸多方面。ISSR (inter-simple sequence repeat) 標(biāo)記技術(shù)由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等于1994年提出[4]，該方法操作簡單，所顯示的遺傳多態(tài)性高且重復(fù)性好，已廣泛應(yīng)用于厚樸[5]、苦瓜[6]、牡丹[7]、長豇豆[8]等植物的研究。ISSR的引物具有通用性，但不同植物所需的引物有所不同，且就同一植物而言，不同引物的擴(kuò)增效果也各有差異，因此需要從大量引物中篩選出適合供試物種PCR的引物。另外，同一引物用于不同植物的PCR時，其最佳退火溫度也有差異，如引物815，在厚樸的ISSR-PCR中最佳退火溫度為53.7℃，但在苦瓜、紫椴[9]中卻分別為50.3和51.2℃；又如引物835，在厚樸、長豇豆、紫椴中的最佳退火溫度分別為56.1、49.2和51.4℃。因此，在試驗中有必要對引物進(jìn)行最佳退火溫度的篩選。

本試驗以蘆筍為供試材料，針對ISSR反應(yīng)的特點，對不同引物及各種退火溫度進(jìn)行測試，篩選出適用于蘆筍的引物及其最佳退火溫度，并以此對收集自5個國家的26份蘆筍品種進(jìn)行ISSR分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗所用的蘆筍材料均來自山西省農(nóng)科院蔬菜所蘆筍資源圃，分別收集自美國、荷蘭、西班牙、加拿大及我國各地，共計26份，見表1。

表1 26份蘆筍品種的名稱及來源

為了提高試驗效率，從前人的研究中初步篩選出了28個[10～12]ISSR引物(表2)，然后再對這些引物做進(jìn)一步的篩選。所用28條ISSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司根據(jù)哥倫比亞大學(xué)公布的引物序列合成。dNTPs、DNAmarker、Taq酶等試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 DNA提取與PCR反應(yīng)體系及程序

采用小量CTAB法提取蘆筍基因組DNA并做改良。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ISSR-PCR基本反應(yīng)體系為25 μL，其中包括：10×Buffer 2.5 μL，DNA模板2.0 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.2 μL，引物(20 μmol·L-1)2.0 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，最后加入18.2 μL ddH2O補齊到25 μL。反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，具體程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，設(shè)定溫度退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

表2 初選出的28條供試引物

注：Y=嘧啶，R=嘌呤，B=無A，D=無C，H=無G，V=無T。

Note: Y=pyrimidine, R=purine, B=no A, D=no C, H=no G, V=no T.

1.3 引物篩選

選用來自不同國家的5個蘆筍品種為供試材料，分別為：美國的Apollo、荷蘭的Gijnlim、西班牙的Pacific Purple、加拿大的Mill和中國的冠軍。以這5份蘆筍基因組DNA為模板，設(shè)定退火溫度為50℃，從初選出的28條ISSR引物中選出能擴(kuò)增出多個清晰條帶的引物。

1.4 最佳退火溫度篩選

優(yōu)化退火溫度時以品種Apollo為樣本，將溫度梯度設(shè)為57～47℃，采用PCR儀自動生成的8個溫度(57.0、56.3、55.1、53.3、51.0、49.3、47.9、47.0℃)對篩選出的引物進(jìn)行不同退火溫度下擴(kuò)增效果的檢驗，遵照條帶清晰和擴(kuò)增位點多2個標(biāo)準(zhǔn)，篩選出最佳退火溫度。

1.5 26份蘆筍品種的ISSR分析

用篩選出的18條引物分別在最佳退火溫度下對26份蘆筍品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，電泳緩沖液為1×TAE，電壓為3 V·cm-1。電泳后在凝膠成像儀中觀測結(jié)果并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物的確定

根據(jù)引物篩選結(jié)果圖確定適合蘆筍ISSR-PCR的引物共18條(表2)，部分篩選結(jié)果見圖1。由圖1可見，第13、14、17、18泳道的擴(kuò)增條帶較好，第11、12、15、21泳道次之，第1、24泳道最差，幾乎無可見條帶。

圖1 部分引物篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of a part of primers注：1～24分別為：引物806、807、808、809、814、816、819、835、836、841、861、865、866、873、888、889、890、815、823、825、827、843、849、851。Note：1～24 are primer 806, 807, 808, 809, 814, 816, 819, 835, 836, 841, 861, 865, 866, 873, 888, 889, 890, 815, 823, 825, 827, 843, 849, 851.

2.2 最佳退火溫度的確定

采用8個溫度梯度對篩選出的18條引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，根據(jù)不同退火溫度下的擴(kuò)增效果確定各引物的最佳退火溫度，引物823和827在不同退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 引物823的退火溫度梯度優(yōu)化Fig.2 Gradient optimization of annealing temperature of primer 823注：1～8分別為57.0、56.3、55.1、53.3、51.0、49.3、47.9、47.0℃。圖3同。Note:1～8 are 57.0, 56.3, 55.1, 53.3, 51.0, 49.3, 47.9, 47.0℃.The same as in Fig.3.

圖3 引物827的退火溫度梯度優(yōu)化Fig.3 Gradient optimization of annealing temperature of primer 827

由圖3可以看出，第8泳道的擴(kuò)增條帶數(shù)最多且條帶清晰，因此該引物的最佳退火溫度為47.0℃。18條引物的最佳退火溫度結(jié)果見表3。從表3可以看出，不同引物間最佳退火溫度差異較大，溫度最高的是引物815、835、841、892，為57.0℃，溫度最低的是引物873，為47.0℃，二者相差10℃。

2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的18條ISSR引物對26份蘆筍種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見表3?？梢钥闯?，這些引物對蘆筍各品種的擴(kuò)增效果雖然有差異，但多態(tài)性都較高。18條引物共擴(kuò)增出DNA片段145條，其中多態(tài)性條帶111條，多態(tài)性位點比例為76.6%。引物823對部分蘆筍品種的擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

表3 篩選出的18條引物及其擴(kuò)增結(jié)果

圖4 引物823對部分蘆筍品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of some varieties of asparagus with primer 823

2.4 聚類圖分析

應(yīng)用UPGMA對各蘆筍品種的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行相似系數(shù)分析，結(jié)果見圖5。由圖5可見，所有品種的遺傳距離都大于零，且能夠聚在一起，表明各蘆筍種質(zhì)資源之間具有相同的遺傳背景，但相互之間也存在一定的差異。在相似系數(shù)0.78處劃線，可將26份蘆筍品種分為5個類群，第一類是4個美國品種和荷蘭的Avalim，第二類是美國的Apollo、加拿大的Mill、荷蘭的Fortems，共3個品種，第三類是西班牙的4個品種，第四類主要是荷蘭和我國江西的一些品種，第五類是山東的097和0914。

從分類結(jié)果看，產(chǎn)地與聚類結(jié)果具有一定的相關(guān)性，如來源于江西的井岡紅(17號)和JK102(19號)首先聚為一類，相似系數(shù)高達(dá)0.93。但不同國家的品種也可能表現(xiàn)出較高的相似性，如荷蘭的Gijnlim(8號)和山東的TC(24號)。同時，同一國家的不同材料間也可能表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性，如荷蘭的Avalim(6號)和Gijnlim(8號)，分別聚在第1、4類群。

圖5 蘆筍種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖(品種編號見表1)Fig.5 UPGMA tree of germplasm resources of asparagus (varieties numbers are in Table 1)

3 討論與結(jié)論

不同植物所適用的ISSR引物有所不同，本試驗篩選出適用于蘆筍的引物共18條，并對其擴(kuò)增效果進(jìn)行了檢測，所擴(kuò)增出的條帶數(shù)較多且清晰，能夠顯示出較強的遺傳多樣性，可用于蘆筍遺傳多樣性的分析研究。

根據(jù)公式“Tm=4(G+C)+2(A+T)”和“最佳退火溫度=Tm-5℃”可以推算出某一引物理論上的最佳退火溫度，但同一引物在不同植物中的最佳退火溫度不盡相同，且與理論值相差較大，甚至不具有明顯的相關(guān)性[13]。本試驗對所篩選出的引物進(jìn)行了退火溫度的梯度篩選，確定了它們的最佳退火溫度，為今后蘆筍的ISSR分子標(biāo)記研究提供了參考。

本試驗利用ISSR技術(shù)對26份蘆筍材料進(jìn)行分析，構(gòu)建了聚類圖，揭示了各品種之間的親緣關(guān)系。試驗的一些聚類結(jié)果與前人的研究相符，如在代真真[10]和李霞[14]的研究中，都有美國和荷蘭一些品種親緣關(guān)系接近的現(xiàn)象，本試驗聚類結(jié)果中的第一類也是如此。蘆筍作為雌雄異株植物，進(jìn)化程度較高，即便是同一品種，個體間也可能存在遺傳差異，因此，為了給蘆筍育種工作提供更可靠的幫助，還應(yīng)收集更多的種質(zhì)資源，結(jié)合其他分子標(biāo)記技術(shù)以及形態(tài)學(xué)等方法進(jìn)行更深入的研究，以取得更大的研究成果。

參 考 文 獻(xiàn)

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