肖建軍，趙遠(yuǎn)榮，劉 劍，楊玉萍

（云南北方光電儀器有限公司，昆明 650114）

前言

西雙版納自然 環(huán)境試驗(yàn)站始建于1962年，隸屬于中國(guó)兵器工業(yè)集團(tuán)公司第二九八廠，是國(guó)防科技工業(yè)環(huán)境試驗(yàn)與觀測(cè)站網(wǎng)十大自然試驗(yàn)站之一，也是國(guó)家材料環(huán)境腐蝕試驗(yàn)臺(tái)網(wǎng)的示范站，是我國(guó)唯一一個(gè)熱帶雨林環(huán)境試驗(yàn)站。試驗(yàn)站位于云南省西雙版納州景洪市大勐龍鎮(zhèn)，東經(jīng)100°4022″，北緯21°34′48″，海拔為626 m，距昆明789kg，距景洪59km；年平均溫度21.6℃，年最高溫度為34℃～38.3℃，平均相對(duì)濕度83%，平均日照時(shí)數(shù)1716h，平均降雨量1713mm，年輻射總量3651MJ/m2，雨水pH值為6.6；屬于典型的熱帶雨林氣候[1]。由于西雙版納自然環(huán)境試驗(yàn)站屬于典型熱帶雨林氣候環(huán)境，霉菌生長(zhǎng)旺盛，對(duì)光電材料、高分子材料、涂料、油脂材料的老化和霉蛀，以及對(duì)金屬材料的腐蝕非常明顯，是開展環(huán)境試驗(yàn)、霉菌試驗(yàn)防霉研究的理想場(chǎng)所。

本研究對(duì)試驗(yàn)站環(huán)境中的真菌進(jìn)行分離，采用真菌的經(jīng)典分類和ITS區(qū)間序列相結(jié)合的方法對(duì)主要類群進(jìn)行鑒定。以了解試驗(yàn)站環(huán)境中主要真菌類群，從而更好的開展環(huán)境試驗(yàn)與霉菌試驗(yàn)防霉研究。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基（g/L）

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20）；馬丁培養(yǎng)基（葡萄糖1 0，蛋白胨5，K H2P O41，MgSO4·7HO20.5g，孟加拉紅0.033，瓊脂20）；沙保弱培養(yǎng)基（葡萄糖40，蛋白胨10，瓊脂15）；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（麥芽汁5°Be′，瓊脂20）；察貝克瓊脂培養(yǎng)基（NaNO33，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01，蔗糖30，瓊脂18）；誘發(fā)真菌孢子的培養(yǎng)基（KH2PO41，MgSO4·7HO20.5g，KNO31，KCl 0.5，淀粉0.2，蔗糖0.2，葡萄糖0.2，瓊脂20）。

1.2 主要試劑和儀器

2×Power Taq PCR MasterMix購(gòu)自昆明碩陽科技有限公司，引物ITS1和ITS4由大連寶生物有限公司合成。超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IC，蘇凈集團(tuán)安泰公司）；恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-40×50，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）；光學(xué)顯微鏡（B H-2，日本OLYMPUS）；電泳儀（POWER PAC 3000 美國(guó)BIO-RAD)；凝膠成像儀( SYDR/1305 美國(guó)Syngene 公司)；離心機(jī)( 美國(guó)Thermo 公司)；PCR擴(kuò)增儀( PTC-200 美國(guó)MJ Re sarch 公司)。

1.3 真菌的分 離

采用自然沉降法收集分離環(huán)境試驗(yàn)站真菌：將裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放置于離地面1.5 m處，打開培養(yǎng)皿蓋子1-3 min后，蓋上皿蓋，靜置于28℃±1℃的培養(yǎng)箱中3～7 d。挑取單菌落的菌絲或孢子于PDA斜面上進(jìn)行 純化和保藏。

1. 4 真菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察

采用插片和點(diǎn)植培養(yǎng)方法，對(duì)分離得到的菌株通過顯微形態(tài)和菌落形態(tài)特征的觀察進(jìn)行屬的鑒定，鑒定檢索參照文獻(xiàn)［2～7］。

1.4.2 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

D N A 的提取方法參照[8]；I T S 區(qū)間序列的P C R 擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[9]。引物I T S 1（5′-T C C G T AGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）。PCR擴(kuò)增程序94℃10 min；94℃45s，54℃1min；72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增的目標(biāo)產(chǎn)物。所得產(chǎn)物送上海某公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

本次試驗(yàn)從試驗(yàn)站環(huán)境中收集分離82株真菌，根據(jù)菌落形態(tài)及其出現(xiàn)的頻率將其合并成16株：F1-7、F2-4、F2-12、F5-4、F7-5、F1-6、F2-1、F1-8、F2-6、F1-9、F4-1、F3-5、F3-9、F3-13、F6-2和F2-2，其中F1-7、F2-4、F2-12、F5-4和F7-5出現(xiàn)頻率最高，為本次分離真菌的主要類群。

2.1 分類鑒定

采用插片和點(diǎn)植培養(yǎng)法，對(duì)16株真菌進(jìn)行顯微形態(tài)和菌落形態(tài)的觀察，結(jié)果歸屬為2個(gè)綱、4個(gè)目、5個(gè)科、10個(gè)屬。見表1。

從表1看到，16株環(huán)境真菌為絲孢綱的最多，有13株；絲孢目的有11株，占68.75%，暗色孢科和叢梗孢科的各有7株和4株，分別占43.75%和25%。

2.2 種的鑒定

對(duì)5株主要類群的菌株（F1-7、F2-4、F2-12、F5-4和F7-5）進(jìn)行DNA的提取和ITS區(qū)間序列的PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)產(chǎn)物送到上海某公司測(cè)序。將所獲得的序列采用DNAstar軟件進(jìn)行圖譜分析，進(jìn)行人工校對(duì)，校正后的序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，選取與供試菌株關(guān)系較近的相關(guān)菌株序列，用ClustalX 1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Meg 4. 0軟件的鄰接法Neighbor-Joining，進(jìn)行1000次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1）。

通過插片法觀察菌株的菌絲有無隔膜、直徑和 顏色，孢子梗和分生孢子的著生方式、形態(tài)大小和顏色等和點(diǎn)植培養(yǎng)法觀察菌落的生長(zhǎng)狀況（質(zhì)地、顏色、生長(zhǎng)速度及特性等），分子孢子梗束、分生孢子座和剛毛的有無；結(jié)合ITS區(qū)間序列分析結(jié)果，確定了5株菌的分類學(xué)地位（見表2）。其中菌株F1-7 ITS區(qū)間序列分析結(jié)果與Periconia sp. CY198（HQ608027）的相似性為99.8%，與Periconia macrospinosa OTU310（JQ846071）的相似性僅為95.8%，所以本次只能將它鑒定為黑團(tuán)孢屬Periconi，將它視作1個(gè)潛在的新分類單元。其余4株分別鑒定為十字斯氏格孢Spegazzinia tessarthra，黃綠木霉Trichoderma aureoviride，黑曲霉Aspergillus niger，Dissoconium dekkeri．

表1 西雙版納自然環(huán)境試驗(yàn)站真菌的分類鑒定

3 討論

圖1 基于ITS 區(qū)間序列和Neighbor-Joining 分析繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 西雙版納自然環(huán)境試驗(yàn)站5 個(gè)主要真菌類群的分類學(xué)地位

本次對(duì)西雙版納自然環(huán)境試驗(yàn)站的環(huán)境真菌進(jìn)行收集、分離和鑒定表明，試驗(yàn)站環(huán)境中的真菌種群較多。中華人民共和國(guó)國(guó)家軍用標(biāo)準(zhǔn)GJB 150.10A-2009中所選用的環(huán)境試驗(yàn)霉菌主要以曲霉屬Aspergillus、青霉屬Penicillium為主，還有木霉屬Trichoderma、球毛殼屬Chactomium、帚霉屬Scopulariopsis和擬青霉屬Paecilomyces；本次收集分離的環(huán)境真菌除有曲霉屬、青霉屬和木霉屬真菌外，其余除斯氏格孢屬Spegazzinia的6個(gè)屬真菌均為病原菌，其中的黑團(tuán)孢屬真菌還是腐生菌；彎孢霉屬Curvularia真菌不僅是禾本植物的寄生菌和腐生菌，還能參與生物降解，定殖并降解纖維素材料，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要分布于空氣中；芽枝霉屬Cladosporium真菌能導(dǎo)致食品、織品的腐爛，并能引起多種植物病害，有些還能引起人及畜類疾病[10～12]。除中華人民共和國(guó)國(guó)家軍用標(biāo)準(zhǔn)GJB 150.10A-2009中所選用的環(huán)境試驗(yàn)霉菌外，本次分離的黑團(tuán)孢屬、彎孢霉屬和芽枝霉屬真菌可能會(huì)對(duì)軍工產(chǎn)品有一定的腐蝕性，在環(huán)境試驗(yàn)和霉菌試驗(yàn)防霉研究工作方面作為試驗(yàn)霉菌來研究將有很好的科學(xué)意義。

[1]西雙版納自然環(huán)境試驗(yàn)站[J].裝備環(huán)境工程,2009,6(2):98-99.

[2]魏景超．真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979．

[3 H.L.巴尼特,B.B 亨特(著),沈崇堯(譯)．半知菌屬圖解[M].北京：科學(xué)出版社, 1977．

[4]邢來君,李明春．普通真菌學(xué)[M].北京：高等教育出版社,1999．

[5]Qiong Wu, Yaqian Li, Yingying Li, et al. Identif ication of a Novel Fungus, Leptosphaerulina chartarum SJTU59 and Characterization of Its Xylanolytic Enzymes[J]. PLOS ONE, 2013,8(9):1-14.

[6]P.W. Crous, B.A. Summerell, A.J. Carnegie, et al. Novel species of Mycosphaerellaceae and Teratosphaeriaceae[J]. Persoonia,2009,23:119-146.

[7]趙國(guó)柱.中國(guó)磚格絲孢菌20 屬的分類及5 個(gè)相似屬代表性種的分子系統(tǒng)學(xué)研究[D].北京:農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[8]Nisiotou AA, Spiropoulos, Nychas G-JE AE. Yeast Community Structures and Dynamics in Healthy and Botrytis-Affected Grape Must Fermentations[J]. Appled and Enviornment Microbiology.2007,73(21):6705-6713.

[9]White TJ, Bruns TD, Lee S, Taylor JW. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 1990, 18, 315-322.

[10]姜于蘭.中國(guó)中西部亞熱帶及川西高原地區(qū)土壤暗色絲孢菌分類研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2007．

[11]雷亞萍.中國(guó)南方3 省區(qū)煤污病和蠅糞病病原菌多樣性研究[D].陜西:西北農(nóng)林科技大學(xué),2011．

[12]張中義,冷懷瓊,張志銘等.病原真菌學(xué)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社,1991．