霍燕芳，高煥瑞，朱莉娜

(天津大學理學院，天津 300072)

苯并咪唑類化合物是一類含苯并咪唑環(huán)的芳香雜環(huán)化合物,具有良好的生物活性，在抗癌、抗真菌、鎮(zhèn)痛消炎、抗風濕、驅(qū)蟲等方面具有重要的應(yīng)用價值[1]。1,10-鄰菲羅啉衍生物是一類具有剛性大的π共軛體系的含氮芳香稠環(huán)化合物，由于其結(jié)構(gòu)易修飾，合成方法簡單，易于與金屬螯合配位，同時具有良好的光學性質(zhì)，可與DNA發(fā)生嵌插結(jié)合，而被廣泛用于分子識別、超分子組裝、功能性配合物制備、DNA生物分子探針、抗腫瘤藥物合成等領(lǐng)域[2-4]。

作者在此設(shè)計合成出3個新的2-(4-羥苯基)咪唑并[4,5-f]1,10-鄰菲羅啉衍生物(化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，對其結(jié)構(gòu)進行了表征，并初步研究了其光譜性質(zhì)及生物活性。其合成路線如圖1所示。

圖1　目標化合物的合成路線

1　實驗

1.1　試劑與儀器

所用試劑均為分析純或色譜純。

Perkin-Elmer 1600 FTIR 型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片法，掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1)；TU-1901型紫外可見分光光度計；RF-5301PC型熒光分光光度計；Mercury Vx 300型核磁共振波譜儀(1HNMR，氘代DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標，掃描頻率300 MHz)；Finnigan Lcqadvantage型質(zhì)譜儀(溶劑為CH2Cl2，直接進樣法，流動相為甲醇，正離子模式測試)；艾科浦微量無機型超純水機；Life Pro 基因擴增儀。

1.2　合成方法

1.2.11,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮(Ⅰ)的合成[5]

將4.0 g 鄰菲羅啉和4.0 g KBr混合均勻，置于圓底燒瓶中，然后緩慢滴加到-10 ℃的40 mL濃H2SO4和20 mL濃HNO3的混合溶液中，將反應(yīng)溫度控制在110～130 ℃，加熱回流3 h，冷卻后倒入500 mL冰水中，然后用40％NaOH溶液中和至pH值為6。用三氯甲烷(100 mL×3)萃取。萃取液用無水Na2CO3干燥，過濾，減壓蒸去三氯甲烷，得到1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮粗品，再用乙醇重結(jié)晶，得到黃色或橙色針狀晶體，即化合物Ⅰ。

1.2.2化合物Ⅱ的合成[6-7]

將1.0 g (4.7 mmol)化合物Ⅰ、4.0 g(51.9 mmol)乙酸銨和1.7 g(143 mmol)對羥基苯甲醛溶于30 mL冰乙酸中，加熱，將溫度控制在85～90 ℃，反應(yīng)3 h后，將反應(yīng)液冷卻到20 ℃左右，然后在冰水冷卻下用氨水中和至pH值為8，立即產(chǎn)生大量黃色沉淀，將沉淀用乙醇與甲醇的混合液重結(jié)晶2次，得黃色晶體，即化合物Ⅱ。

1.2.3化合物Ⅲ的合成[8-9]

將0.4665 g(1.5 mmol)化合物Ⅱ、0.235 g 2-氯乙基-N-甲基哌啶鹽酸鹽和1.5 g Cs2CO3置于圓底燒瓶中，加入50 mL DMF，加熱，溫度控制在50 ℃，反應(yīng)3 d，將反應(yīng)液冷卻，過濾，減壓蒸去DMF，用二氯甲烷溶解，加水洗滌，用玻璃棒攪拌，出現(xiàn)黃色沉淀，取出沉淀用水洗滌，得到黃色固體化合物Ⅲ。同法合成黃色化合物Ⅳ和Ⅴ。

1.3　目標化合物的表征和測試

表征：分別對化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ進行紅外光譜、質(zhì)譜、1HNMR及元素分析。

紫外光譜分析：將化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別用去離子水配成濃度為10 μmol·L-1的溶液倒入1 cm 石英比色皿中進行紫外光譜測試，掃描波長范圍為190～450 nm。

熒光光譜分析：將化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別配制成濃度為10 μmol·L-1的溶液，在激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm的條件下進行熒光光譜測試。

生物活性測試：由于雙鏈DNA(AT、GC)和G-四鏈體DNA(Hum24)能使目標化合物的熒光發(fā)生猝滅，因此，在目標化合物溶液中加入上述DNA，通過測定它們之間的相互作用來研究其生物活性。待測試樣總體積為100 μL，包括10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)、100 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1Na2EDTA。DNA的濃度為0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、15 μmol·L-1、20 μmol·L-1、25 μmol·L-1。每份待測樣品均加熱至95 ℃保持5 min，迅速冷卻至25 ℃保持30 min，然后保持4 ℃過夜[10-14]。再加入5 μmol·L-1目標化合物后進行熒光光譜測定，激發(fā)波長為278 nm，測定波長范圍為300～550 nm，狹縫寬度為5 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1　結(jié)構(gòu)表征

2.1.1紅外光譜分析

實驗發(fā)現(xiàn)，化合物Ⅰ在1 688 cm-1處的強吸收峰為C=O的伸縮振動，證明了鄰菲羅啉被氧化；1 610 cm-1處的強吸收峰為C=N的伸縮振動；3 212 cm-1處強而寬的吸收峰初步推斷為O-H和N-H的伸縮振動，證明合成了化合物Ⅱ。

化合物Ⅲ～Ⅴ的紅外光譜數(shù)據(jù)見表1。

表1　化合物Ⅲ～Ⅴ的紅外光譜數(shù)據(jù)/cm-1

由表1可知：化合物Ⅲ在2 930 cm-1和2 787 cm-1處的強吸收峰，推斷為亞甲基伸縮振動和甲基的伸縮振動；而1 248 cm-1處的吸收峰為C-O的伸縮振動，更進一步驗證了化合物Ⅲ的合成?；衔铫粼? 250 cm-1處的吸收峰為C-O的伸縮振動，2 932 cm-1處的吸收峰為亞甲基的伸縮振動，初步證明了化合物Ⅳ的合成?；衔铫踉? 116 cm-1處的吸收峰為嗎啉側(cè)壁中C-O-C 的骨架伸縮振動，2 932 cm-1處的吸收峰為亞甲基的伸縮振動，也初步證明了化合物Ⅴ的合成。

2.1.2質(zhì)譜分析(表2)

表2　化合物Ⅲ～Ⅴ的主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)

由表2可知，化合物Ⅲ～Ⅴ均能給出與相應(yīng)分子量一致的準分子離子峰，表明這3個化合物為目標產(chǎn)物。

2.1.3元素分析(表3)

表3　化合物Ⅲ～Ⅴ的元素分析數(shù)據(jù)/％

由表3可知，測量值與計算值在誤差允許范圍內(nèi)。

2.1.41HNMR分析(表4)

表4　化合物Ⅲ～Ⅴ的1HNMR分析數(shù)據(jù)/δ

由表4可知，化合物Ⅲ～Ⅴ為目標產(chǎn)物。

由紅外光譜分析、質(zhì)譜分析、元素分析和1HNMR分析可知，化合物Ⅲ～Ⅴ就是2-(4-羥苯基)咪唑并[4,5-f]1,10-鄰菲羅啉衍生物。

2.2　紫外光譜和熒光光譜分析(圖2)

圖2　化合物Ⅲ～Ⅴ的紫外光譜(a)和熒光光譜(b)

由圖2a可看出:化合物Ⅲ～Ⅴ的紫外光譜十分相似，其紫外吸收峰分別位于:200 nm、220 nm、278 nm、288 nm、306 nm、323 nm 處，其中200 nm 處為共軛烯的紫外吸收峰，是由π→π*產(chǎn)生的 K 帶電子躍遷；220 nm 處為 B 帶吸收峰，屬于芳香族化合物的特征吸收峰；278 nm和288 nm處是由n→π*產(chǎn)生的電子躍遷；306 nm和323 nm處的肩峰證明這3個化合物均含有2個以上的共軛體系。

由圖2b可看出，化合物Ⅲ～Ⅴ的熒光光譜十分相似，最大激發(fā)波長(278 nm)和最大發(fā)射波長(467 nm)均相差189 nm，具有較大的斯托克斯位移。由于在鄰菲羅啉的大共軛體系中引入的OR、NR2鄰對位取代基為推電子取代基，p-π共軛引起分子剛性苯環(huán)的電子云密度增大，產(chǎn)生熒光的幾率增大。

2.3　生物活性研究

2.3.1化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)的相互作用(圖3)

圖3　不同濃度的雙鏈DNA(AT、GC)對化合物Ⅲ～Ⅴ的熒光發(fā)射光譜的影響(λex=278 nm)

由圖3可看出，隨著雙鏈DNA(AT、GC)濃度的增加，化合物Ⅲ～Ⅴ的熒光猝滅程度不斷增大，且熒光猝滅程度與雙鏈DNA(AT、GC)濃度呈線性關(guān)系。表明化合物Ⅲ～Ⅴ可以用來定量檢測雙鏈DNA(AT、GC)的濃度。

熒光的猝滅分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅?；鶓B(tài)熒光分子與猝滅劑之間形成基態(tài)復合物引起的猝滅為靜態(tài)猝滅；猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的猝滅為動態(tài)猝滅，其過程遵循Stern-Volmer方程[15]：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

式中：F、F0為有、無猝滅劑時的熒光強度；KSV為猝滅常數(shù)；[Q]為猝滅劑濃度；Kq為猝滅速率常數(shù)；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光壽命約為 10-8s。

由于藥物小分子與生物大分子之間的最大擴散控制的碰撞常數(shù)Kq為2 × 1010L·mol-1·s-1[16]，因此， 可以初步確定化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)的猝滅作用是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅：當猝滅速率常數(shù)大于最大擴散控制的碰撞常數(shù)，可能為形成基態(tài)復合物的靜態(tài)猝滅，反之則為動態(tài)猝滅。

圖4是化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)作用導致熒光猝滅的Stern-Volmer圖譜，由此圖計算化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)作用的Stern-Volmer參數(shù)見表5。

由表5可知，化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)作用的猝滅速率常數(shù)Kq遠大于藥物小分子與生物大分子之間的最大擴散控制的碰撞常數(shù) 2×1010L·mol-1·s-1。因此，雙鏈DNA(AT、GC)對化合物Ⅲ～Ⅴ熒光的猝滅作用不是動態(tài)猝滅，而是形成基態(tài)復合物的靜態(tài)猝滅。

2.3.2化合物Ⅲ～Ⅴ與G-四鏈體DNA(Hum24)的相互作用(圖5)

由圖5可以看出：隨著G-四鏈體DNA(Hum24)濃度的增加，化合物Ⅲ～Ⅴ的熒光強度先減弱后增強，而且伴有藍移現(xiàn)象，這與雙鏈DNA(AT、GC)的熒光猝滅作用不同。表明化合物Ⅲ～Ⅴ不僅可以定量檢測雙鏈DNA(AT、GC)的濃度，而且可以用來區(qū)分DNA的G-四鏈體構(gòu)型及雙鏈構(gòu)型。

圖4　化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)相互作用的Stern-Volmer圖譜

表5　化合物Ⅲ～Ⅴ與雙鏈DNA(AT、GC)相互作用的Stern-Volmer參數(shù)

圖5　不同濃度的G-四鏈體DNA(Hum24)對化合物Ⅲ～Ⅴ的熒光發(fā)射光譜的影響

3　結(jié)論

合成了3個新的2-(4-羥苯基)咪唑并[4,5-f]1,10-鄰菲羅啉衍生物，通過紅外光譜、質(zhì)譜、1HNMR、元素分析對其結(jié)構(gòu)進行了表征，證明成功地合成出目標化合物。3個化合物均具有較強的熒光和較大的斯托克斯位移，使其在光電材料、有機藥物等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。通過研究3個化合物與雙鏈DNA(AT、GC)、G-四鏈體DNA(Hum24)的相互作用，發(fā)現(xiàn)DNA對3個化合物的熒光具有猝滅作用，初步研究了它們的猝滅模式。其中目標化合物的熒光猝滅程度與雙鏈DNA(AT、GC)的濃度呈線性關(guān)系，使得這3個化合物有望被開發(fā)用作熒光猝滅探針檢測雙鏈DNA(AT、GC)的濃度。

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