逄世峰，曲正義，李亞麗，孫成賀，王英平

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春130112)

人參為五加科人參(PanaxginsengC.A.Mey)的干燥根， 自古以來被譽為“草藥之王”。人參皂苷是人參屬植物中重要的活性成分[1，2]，具有抗腫瘤[3]、抗疲勞[4]、降血糖[5]、抗炎[6]以及改善學習記憶能力[7]等多種生物活性。2012年，衛(wèi)生部批準人參作為新資源食品，人參糖作為人參食品的典型代表，已逐步被消費者所認可[8]。作為標志性成分，人參皂苷是人參食品中必測指標[9]。目前，尚未見人參糖中人參皂苷類成分檢測方法的研究。本試驗建立了一種UPLC法測定人參糖中7種人參皂苷的方法，為人參糖中人參皂苷含量測定和質(zhì)量安全提供參考依據(jù)。

1 儀器、試劑和材料

1.1儀器

超高效液相色譜儀ACQUITY(美國Waters公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試劑

乙腈為色譜純(美國fisher公司)，水為超純水(美國Millipore公司)，其他試劑均為分析純(天津津騰實驗設備有限公司)。

1.3材料

人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd(中國藥品生物制品檢定所)；人參硬糖、人參軟糖(康美新開河參業(yè)有限公司)。

2 方法與結果

2.1混合對照品溶液制備

精密稱取7種人參皂苷標準品，配制成含有人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd分別為0.97mg/mL、1.03mg/mL、0.54mg/mL、1.04mg/mL、0.57mg/mL、0.55mg/mL、0.93mg/mL的混合對照品溶液。

2.2色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×50mm，1.7μm)，流動相乙腈-水(梯度洗脫：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～5min，21%～26%乙腈；5min～9min，26%～27%乙腈；9min～12min，27%～32%乙腈；12min～15min，32%～43%乙腈)，流速0.5mL/min，檢測波長203nm，柱溫35℃，進樣量2μL。

2.3線性關系

精密吸取混合對照品溶液0.10mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL，分別定容至10mL容量瓶中，制成一系列濃度的混合標準品溶液，在上述色譜條件下，注入超高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程分別為：Rg1：Y=497 000X-2380(r=0.9995)、Re：Y=651 000X-5240(r=0.9995)、Rf：Y=460 000X-1370(r=0.9995)、Rb1：Y=482 000X-4150(r=0.9995)、Rc：Y=546 000X-2540(r=0.9993)、Rb2：Y=573 000X-2170(r=0.9994)、Rd：Y=433 000X-2780(r=0.9995)。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd線性范圍分別為0.0097mg/mL～0.097mg/mL，0.0103mg/mL～0.103mg/mL，0.0054mg/mL～0.054mg/mL，

0.0104mg/mL～0.104mg/mL，0.0057mg/mL～0.057mg/mL，

0.0055mg/mL～0.055mg/mL，0.0093mg/mL～0.093mg/mL。

2.4供試品溶液的制備

人參硬糖供試品溶液制備：將人參硬糖粉碎，取樣品5g，置三角瓶中，加入蒸餾水60mL，使樣品完全溶解，再加入140mL甲醇，于85℃回流提取6h。將提取液全部轉移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。用蒸餾水溶解提取物，加蒸餾水100mL置分液漏斗中，用乙醚100mL萃取3次，后用水飽和正丁醇100mL萃取3次，再用正丁醇飽和水萃取3次，取上層液蒸干，加甲醇溶解后，轉移至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

人參軟糖供試品溶液制備：將人參軟糖剪碎、研磨，取樣品5g，置三角瓶中，加入蒸餾水60mL使樣品完全溶解，再加入140mL甲醇，于85℃回流提取6h。將提取液全部轉移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。用蒸餾水溶解提取物，加蒸餾水100mL置分液漏斗中，用乙醚100mL萃取3次，后用水飽和正丁醇100mL萃取3次，再用正丁醇飽和水萃取3次，取上層液蒸干，加甲醇溶解后，轉移至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。標準品和樣品UPLC色譜圖見圖1。

2.5精密度試驗

取混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色譜峰面積的RSD(n=6)分別為0.19%、0.21%、0.53%、0.35%、0.67%、0.27%、0.15%。結果表明，儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0h、12h、24h、36h、48h進樣測定，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色譜峰面積的RSD分別為1.03%、0.47%、1.84%、2.37%、0.96%、0.85%、0.79%。結果表明，樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復性試驗

取同一份樣品，制備6份供試品溶液，得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd平均含量的RSD分別為2.76%、2.87%、2.54%、2.93%、2.15%、2.07%、2.46%。結果表明，方法重現(xiàn)性良好。

2.8加樣回收率試驗

取已知含量的樣品，添加一定量的人參皂苷對照品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定(表1)。

表1加樣回收率

Table 1Sample recovery rate (n=6)

2.9樣品含水量測定

按照“GB/T 5009.3”規(guī)定方法[10]測定樣品中水分(表2)。

表2人參糖含水量測定結果

Table 2content of water in ginseng sweets (n=3)

2.10樣品含量測定

按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，以干物質(zhì)計(表3)。

3 討論

3.1提取溶劑的選擇

人參糖中可能添加人參粉、人參提取物等不同人參原料，水提取人參粉中皂苷效果并不理想。因此，應選擇有機溶劑提取。但人參糖中含有大量的糖類，直接用有機溶劑提取，糖類凝結，無法保證提取效果。因此，本研究先用60mL水將人參糖溶解，再加入140mL甲醇提取的方法，可消除上述影響。

表3人參糖中7種人參皂苷含量

Table 3content of seven Ginsenosides in ginseng sweets (mg/g)

3.2樣品取樣量的選擇

稱取樣品過多時，樣品不易溶解，成黏稠狀，不易萃??；稱取樣品過少時，人參皂苷含量較低，影響測定結果。經(jīng)多次摸索，最終確定取樣量為5g。

3.3人參總皂苷純化方法的選擇

本實驗采用溶劑萃取法對人參皂苷進行純化。先用乙醚萃取，對粗提液進行脫脂，再用水飽和正丁醇萃取樣品中人參皂苷，最后用正丁醇飽和水去除樣品中過量的糖類。文獻報道[11，12]采用D-101大孔吸附樹脂進行純化，雖效果較好，但需對大孔樹脂進行預處理、裝柱、洗柱等步驟，方法繁瑣、耗時；而溶劑萃取法簡便、用時少，通過上述萃取方法可消除大部分雜質(zhì)。所以，本實驗采用溶劑萃取法對人參糖中的人參皂苷進行分離純化。

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