張淑琴，譚斌，李鵬，楊勇，孫娜，王鳳雪，郭利，溫永俊，程世鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點實驗室，長春130112)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的牛等動物的重要傳染病。受感染?？杀憩F(xiàn)出多種臨床癥狀，包括肺炎、腹瀉、流產(chǎn)、出血性綜合征等急性感染及持續(xù)性感染和黏膜病，同時，由于BVDV引起的免疫抑制可造成繼發(fā)感染和其他疫苗免疫失敗。據(jù)統(tǒng)計，在每100萬犢牛中，由于BVDV感染造成的損失可達(dá)2000～5700萬美元[1]。該病毒除感染牛外，還可以感染鹿、羊駝、牦牛、駱駝等特種動物，對特種經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖危害較大。

BVDV基因組核酸為單股、正鏈RNA，長約12.3kb，由5′端非編碼區(qū)(5′UTR)、1個大的開放閱讀框(ORF)和3′端非編碼區(qū)(3′UTR)構(gòu)成。大開放閱讀框序列編碼著所有的病毒蛋白，單個病毒蛋白的順序為Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B，多聚蛋白體形成后，經(jīng)宿主細(xì)胞和病毒自身的多種蛋白酶進(jìn)行翻譯和翻譯后加工，生成不同的病毒蛋白[2]。依據(jù)5′UTR基因序列可將牛病毒性腹瀉病毒分為2個基因型，即BVDV1和BVDV2[3]。最近，典型牛瘟病毒(包括Th/04KhonKaen virus，D32/00-‘HoBi’等)被定義為BVDV3型[4]。根據(jù)能否使細(xì)胞發(fā)生病變效應(yīng)將BVDV分為致細(xì)胞病變型CP和非致細(xì)胞病變型NCP 2種生物型[5]。臨床上分離毒株多為非致細(xì)胞病變型。感染非致細(xì)胞病變型BVDV的小牛血清已成為生物制品生產(chǎn)中較大的威脅[4]。因此，快速準(zhǔn)確地檢測BVDV成為預(yù)防和控制牛病毒性腹瀉的關(guān)鍵。常規(guī)檢測BVDV的技術(shù)主要有病毒分離、血清學(xué)試驗等。這些方法對于臨床上無細(xì)胞病變毒株的診斷在敏感性、特異性、時效性等方面都存在各自的缺陷。用于病毒核酸檢測的Real-time PCR技術(shù)以其快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點在基因表達(dá)水平的分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究建立了檢測BVDV的SYBR GreenⅠ Real-time PCR方法，并對臨床感染牛體內(nèi)BVDV進(jìn)行定量檢測，揭示病毒在宿主體內(nèi)各臟器的分布情況。

1 材料和方法

1.1病毒

牛病毒性腹瀉病毒JL毒株(BVDV-1)、牛病毒性腹瀉病毒HEN03毒株(BVDV-2)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛副流感病毒(PI3V)、豬瘟病毒C株(CSFV-C)均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)重點實驗室分離鑒定并保存。

1.2主要儀器和試劑

PCR儀、Bio-rad實時熒光定量PCR儀、ExTaq酶、pMD18-T載體(大連寶生物工程公司)，Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，質(zhì)粒提取與膠回收試劑盒(AXYGEN公司)。

1.3引物的設(shè)計與合成

通過序列比對，根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5′UTR基因保守序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計了1對引物。上游引物BF(5′ GGT AGC AAC AGT GGT GAG TTC 3′)，下游引物BR(5′ CTC AGG TTA AGA TGT GCT GTG 3′)，擴(kuò)增片段136bp，引物由上海生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4病毒RNA提取和cDNA的合成

采用Trizol試劑提取病毒的RNA，提取步驟參照使用說明書進(jìn)行。提取的RNA溶于30μL DEPC 處理的ddH2O，反轉(zhuǎn)錄按照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。

1.5標(biāo)準(zhǔn)品的制備

利用“1.4”項下合成的牛病毒性腹瀉病毒cDNA作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR，反應(yīng)體系25μL：cDNA模板2μL、上下游引物(10pmol)各1μL、dNTP(2.5mM)2μL、10×Ex Buffer 2.5μL、ExTaqTMDNA 聚合酶0.25μL、ddH2O 16.25μL。反應(yīng)條件：95℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 20s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的DNA片段連接pMD18-T載體轉(zhuǎn)化后挑單克隆提取質(zhì)粒送測序，序列正確質(zhì)粒利用紫外分光光度計測其D260nm和D280nm值，并計算出每微升拷貝數(shù)。

1.6SYBRGreenⅠreal-timePCR反應(yīng)條件

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比梯度稀釋，并進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系按照SYBR Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10s；95℃ 5s，60℃ 20s，共40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時檢測熒光信號。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線由實時熒光定量PCR儀自動進(jìn)行。

1.7敏感性、特異性和重復(fù)性試驗

用牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型和豬瘟病毒的核酸進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，以此確定該檢測方法的特異性；方法敏感性的檢測采用10倍倍比稀釋108copies/μL～101copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，確定檢測的最低濃度限。選擇2份牛病毒性腹瀉病毒1型(BVDV-JL)感染病料和1份牛病毒性腹瀉病毒2型(BVDV-HEN03)感染病料，提取病毒核酸并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行real-time PCR檢測，每個樣品重復(fù)3次，確定批內(nèi)重復(fù)性。批間重復(fù)性是在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨立的real-time PCR檢測。

1.8臨床病例主要臟器的病毒分布檢測

臨床病例的主要臟器樣品來源于分離BVDV-JL毒株的病死牛臟器[7]，主要包括脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、腎臟、肝臟、肺臟和心臟等臟器。各臟器凍存于-70℃冰箱中。提取各臟器總RNA，通過Real-time PCR檢測各臟器病毒含量。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒濃度的計算

質(zhì)粒濃度為12.7μg/μL，A260/A280為1.83，根據(jù)公式(6.02×1023copies/moL)×(濃度g/μL)/(MWg/moL)=copies/μL計算其拷貝為4.1×108copies/μL。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

實時熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化后結(jié)果顯示，BVDV的標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率E為95.9%(圖1)，熔解曲線為單一峰值，Tm值為85.5。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小為136bp左右

2.3熒光定量PCR的敏感性

Real-time PCR檢出的最低限為4.1×101copies/μL，常規(guī)PCR的檢測極限為4.1×103copies/μL(圖2)，其靈敏度為常規(guī)PCR的100倍左右。

2.4熒光定量PCR的特異性

熔解曲線結(jié)果表明，只有BVDV才能擴(kuò)增出特異性峰，Tm值為85.5，而對其它牛源病毒(IBRV、BRSV、BPI3V)和豬瘟病毒(CSFV)檢測結(jié)果均為陰性(圖3)。

2.5熒光定量PCR的重復(fù)性

取3份不同病料，將提取的牛病毒性腹瀉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，統(tǒng)計分析表明，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)0.4%～0.8%，批間變異系數(shù)(CV)1.3%～2.2%(表1)。

表1Real-timePCR檢測3份不同病料的批內(nèi)和批間重復(fù)檢測結(jié)果

Table 1Reproducibility of intra-and inter-assay of Real-time PCR

2.6臨床病料病毒檢測

對凍存于-70℃冰箱中臨床病料采用Real-time PCR方法檢測各臟器病毒含量。胸腺、淋巴結(jié)和脾臟的病毒含量最高，其中，胸腺的病毒含量為8.94×106copies/μL，肺臟、腎臟、心臟和肝臟也檢測到不同含量的病毒核酸，但在病毒分離中均未能夠分離到病毒。

3 討論

牛病毒性腹瀉/黏膜病呈世界性分布，給世界養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的迅速發(fā)展，目前已有20多個省、市、自治區(qū)存在該病。本研究前期流行病學(xué)調(diào)查表明，多數(shù)省份牛病毒性腹瀉病毒血清中和抗體陽性率高達(dá)70%。在我國，目前還沒有商品化的疫苗，因此診斷成為防治該病的重要措施。BVDV與CSFV同科同屬，在免疫學(xué)上存在著交叉性，臨床上豬感染BVDV癥狀與豬瘟類似，應(yīng)用常規(guī)血清學(xué)方法很難將兩者區(qū)分。常規(guī)PCR檢測雖然較常規(guī)分離病毒相比靈敏度高，但由于檢測過程中需要進(jìn)行電泳，容易污染。而Real-time PCR技術(shù)可以實時監(jiān)測反應(yīng)過程中的擴(kuò)增產(chǎn)物，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以準(zhǔn)確定量病毒核酸的拷貝數(shù)，試驗結(jié)果無需再進(jìn)行電泳評估，大大節(jié)省了試驗時間和反應(yīng)的靈敏度[8]。

本試驗建立了牛病毒性腹瀉病毒實時熒光定量PCR檢測方法，該方法所建立的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2=0.999；擴(kuò)增效率E=95.9%)，熔解曲線在40個循環(huán)內(nèi)無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增，且與其它牛源病毒及豬瘟病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該方法具有高度的特異性；該方法可檢測到初始模板中4.1×101copies/μL的病毒核酸，其靈敏度為常規(guī)PCR的100倍；重復(fù)性試驗結(jié)果變異系數(shù)0.4%～2.2%，表明該方法具有很好的重復(fù)性。應(yīng)用所建立的Real-time PCR方法檢測了臨床上牛病毒性腹瀉病毒感染牛各臟器病毒含量，胸腺、淋巴結(jié)和脾臟等淋巴組織中病毒含量最高，其中胸腺的病毒含量為8.94×106copies/μL；肺臟、腎臟、心臟和肝臟也檢測到不同含量的病毒核酸，但在病毒分離中均未能夠分離到病毒[7]。該結(jié)果表明，病毒主要侵害淋巴器官，此研究可為臨床病例選擇病理組織進(jìn)行病毒分離提供依據(jù)。

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