閆梅霞，崔麗麗，許世泉，劉俊霞，王英平※

(1．中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112； 2．吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林 吉林 132101)

雙向固態(tài)發(fā)酵又稱新型固體發(fā)酵，是指具有活性成分的藥性基質(zhì)被藥用真菌發(fā)酵，它既能提供真菌所需營養(yǎng)大量生長菌體，同時又能因真菌的酶而改變其原來的成分，發(fā)酵具有雙向性，產(chǎn)品稱為藥性菌質(zhì)[1]。人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有益氣補虛、安神降壓、益氣生津之功效?，F(xiàn)代藥理研究證實，人參皂苷是發(fā)揮其藥理作用的主要活性成分，人參皂苷Rb2、Rb3為原二醇型人參皂苷，對心肌缺血有保護作用[2]，二者組合物對大鼠急性心肌梗死有保護作用[3]，Rb3還具有降血糖，抗氧化等作用[4]。我國利用發(fā)酵法炮制中藥的歷史悠久，目前在用的片仔癀、六神曲[5]、半夏曲[6]等都是發(fā)酵中藥，且均為多菌種發(fā)酵，中藥通過發(fā)酵達到了減毒增效和增加新藥效的目的?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的進步、藥用菌深層發(fā)酵研究、中藥藥理研究的深入為發(fā)酵中藥提供了研究基礎(chǔ)，中藥發(fā)酵研究越來越受到關(guān)注。添加中藥有效成分的液態(tài)發(fā)酵[7]、以中藥為添加物或底物的固態(tài)發(fā)酵[8]和復方中藥的發(fā)酵[9]均證實藥用菌能夠?qū)χ兴幍乃幮С煞诌M行轉(zhuǎn)化。本研究對人參皂苷Rb2、Rb3在藥用菌赤芝固態(tài)發(fā)酵過程中含量動態(tài)變化進行研究，分析雙向固態(tài)發(fā)酵對人參藥效成分的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

赤芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所質(zhì)量評價實驗室分離純化保藏。

1.2 培養(yǎng)質(zhì)

試管、平板菌種培養(yǎng)基(復合PDA配方)；液體菌種培養(yǎng)基(PDB配方)；固體發(fā)酵培養(yǎng)基(人參須切段，輔料為純凈水，料∶水1∶2，121℃滅菌25min，制作為人參須發(fā)酵基質(zhì))。

1.3 發(fā)酵工藝

試管菌種平板復壯后制作液體菌種，液體菌種180r/min 24℃暗培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2級菌種，培養(yǎng)3d后接種于固體發(fā)酵基質(zhì)，接種量10%。

1.4 發(fā)酵過程與樣品測定

于整個發(fā)酵培養(yǎng)過程的1d、2d、4d、6d、8d、10d、13d、16d、20d、24d、28d、32d進行觀察和取樣，滅菌后的基質(zhì)為空白對照。樣品按1∶10(g/mL)加入甲醇，超聲30min，連續(xù)3次。超高效液相色譜儀測定，Rb2檢出限0.55、定量限為1.84；Rb3檢出限1.41、定量限4.70。

1.5 儀器與試劑

MJX-100B-Z霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；LDZX-75KBS滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；ACQUITY超高效液相色譜儀(Waters公司)；人參皂苷標準品Rb2和Rb3(四川維克奇生物科技有限公司)；其余試劑為分析純。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長狀態(tài)分析

赤芝菌絲在人參須基質(zhì)上生長，大約20d左右可以長滿整個基質(zhì)，然后隨著培養(yǎng)時間的延長，大約30d左右觀察到基質(zhì)出現(xiàn)缺水現(xiàn)象。菌絲在基質(zhì)上生長時未見氣生菌絲旺盛的表現(xiàn)，也沒有出現(xiàn)厚菌膜(圖1)。

2.2 發(fā)酵過程中皂苷含量變化分析

赤芝雙向固態(tài)發(fā)酵對2種人參皂苷有轉(zhuǎn)化作用，發(fā)酵過程含量變化顯著。Rb2在發(fā)酵初期1d～2d含量顯著升高，2d～20d含量逐漸降低，20d時含量遠低于對照，20d～24d含量顯著升高，24d含量介于發(fā)酵4d～8d之間，24d～28d含量顯著降低，28d～32d未檢測出。Rb3在發(fā)酵0d～2d含量升高，1d～2d含量接近，2d～24d含量逐漸降低，24d～32d未檢測出。整個發(fā)酵過程中2種皂苷含量的變化過程不相同，Rb2含量有2次升高過程，Rb3有1次升高過程；Rb2完全轉(zhuǎn)化需28d，Rb3完全轉(zhuǎn)化需24d。赤芝固體發(fā)酵不同時期可以獲得皂苷含量不同的發(fā)酵基質(zhì)(圖2)。

2.3 菌絲生長與皂苷含量分析

結(jié)合圖1和圖2進行分析，在接種后0d～6d，2種皂苷含量出現(xiàn)先升高后降低的變化，說明從液體菌種到固體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲過程中，在菌體酶系作用下，Rb2和Rb3含量變化顯著；6d～20d菌絲逐漸長滿基質(zhì)，2種皂苷含量均逐漸減低，說明伴隨菌絲長滿基質(zhì)皂苷含量降低。菌絲長滿基質(zhì)后，Rb3含量繼續(xù)減少直到基質(zhì)中檢測不到；Rb2含量出現(xiàn)先升高后降低為0的過程，說明發(fā)酵后期隨著菌體對基質(zhì)的持續(xù)利用，不同皂苷含量變化相差較大。

3 討論

利用真菌發(fā)酵對人參皂苷進行轉(zhuǎn)化具有積極意義。劉洋選用黑根霉對紅參水煎液進行液態(tài)發(fā)酵研究證實，發(fā)酵產(chǎn)物增強記憶活性顯著高于紅參水煎液。發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜檢測證實，人參皂苷組分發(fā)生變化，稀有皂苷Rg3、Rg5等增加；王洪峰報道，人參固態(tài)發(fā)酵30d后總皂苷含量減少，但稀有皂苷Rg3、Rh1含量增加。本試驗對赤芝、人參雙向固態(tài)發(fā)酵進行了研究，證實赤芝固態(tài)發(fā)酵對人參皂苷Rb2和Rb3有轉(zhuǎn)化作用，并且伴隨發(fā)酵的進行，能夠降低其在基質(zhì)中的含量。

[1]莊毅.中藥內(nèi)的生物制藥——固體發(fā)酵工程系列及其真菌藥物[J].菌物研究,2013,11(2):63-71.

[2]劉玉蓮.人參皂苷Rb組單體和Rd對心肌缺血干預(yù)作用及機制的研究[D].長春:吉林大學,2009.

[3]王友聯(lián),劉一鳴,孫偉倫,等.人參皂苷Rb3及Rb2組合物對大鼠實驗性心肌梗死的保護作用[J].人參研究,2012,(2):2-5.

[4]孟凡麗,蘇曉田,鄭毅男.人參皂苷Rb3對糖尿病模型小鼠的降血糖和抗氧化作用[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2013,34(4):553-557.

[5]鄒吉野,李瑩,王德馨,等.六神曲的發(fā)酵菌種分離及純種發(fā)酵考察[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(16):12-14.

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[7]劉洋.紅參水煎液的液體發(fā)酵工藝優(yōu)化及產(chǎn)物藥理活性研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學,2012.

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[9]蘇建樹.雙向固態(tài)發(fā)酵附桂骨痛復方化學成分的研究及HPLC指紋圖譜的建立[D].北京:北京化工大學,2010.