仝明薇，易立，程世鵬

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

毛皮動(dòng)物細(xì)小病毒性腸炎是由細(xì)小病毒引起的一種急性傳染病，在我國(guó)及世界范圍內(nèi)頻有發(fā)生。細(xì)小病毒在毛皮動(dòng)物(狐貍、貉、水貂)中廣泛傳播，給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)小病毒(Parvovirus)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，為線性負(fù)鏈單股DNA病毒[1]。

PCR檢測(cè)方法是一種相對(duì)準(zhǔn)確的診斷方法，但較實(shí)時(shí)定量PCR方法費(fèi)時(shí)，且存在一定的漏檢。熊煒[2]等研究報(bào)道，應(yīng)用TaqMan探針的實(shí)時(shí)定量PCR方法比常規(guī)PCR法顯著提高了陽(yáng)性檢出率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量2種方法。絕對(duì)定量需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線[3，4]；相對(duì)定量是以表達(dá)恒定的內(nèi)參基因?yàn)閷?duì)照，獲得目的基因表達(dá)量的變化[5]。絕對(duì)定量能夠獲得目的基因準(zhǔn)確的表達(dá)量，但不同樣品需要不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品，操作繁瑣。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量方法對(duì)規(guī)模化毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)的樣品進(jìn)行細(xì)小病毒載量的快速定量檢測(cè)，并獲得了理想的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品來(lái)源

吉林省某毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)糞便樣品12份(狐糞便樣品2份、犬糞便樣品3份、貉糞便樣品7份)、貉血液樣品5份。

1.2 主要試劑

BloodGen mini Kit、StoolGen DNA Kit、2x ULtraSYBR Mixture(康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1病毒DNA提取臨床糞便樣品DNA提取參考StoolGen DNA Kit，血液樣品DNA提取參考BloodGen mini Kit，提取的DNA用無(wú)核酸酶水溶解，-20℃保存。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與常規(guī)PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank已發(fā)表的CPV-SC-JM VP2序列，應(yīng)用Premier5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度1 105bp。

上游：5′-ATCTGAGACATTGGGTTT-3′

下游：5′-TTTCTAGGTGCTAGTTGA-3′

PCR反應(yīng)采用25μL體系：10×Buffer 2.5μL、dNTPs 2μL、上下游引物各1μL、Taq酶0.5μL、模板2μL、ddH2O 16μL。95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.3利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法檢測(cè)臨床樣品利用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法檢測(cè)17份規(guī)模化毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床樣品。應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。細(xì)小病毒CPV-SC-JM VP2目的基因引物和內(nèi)參基因引物序列如下：

VP2上游：5′-TCAACCTGCTGTCAGAAAT-3′

VP2下游：5′-AAGTACCCGTAGAAATCCC-3′

β-actin上游：5′-GGCTGTGCTGTCCCTGTAC-3′

β-actin下游：5′-CCGGAGTCCATCACGATGC-3′

對(duì)12份糞便樣品及5份血液樣品進(jìn)行SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法檢測(cè)，選用β-actin作為內(nèi)參基因，并用PBS做空白對(duì)照。

PCR反應(yīng)采用20μL體系：2×ULtraSYBR Mixture 10μL、VP2/β-actin上游引物1μL、VP2/β-actin下游引物1μL、樣品DNA模板2μL、ddH2O 6μL。95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中細(xì)小病毒的常規(guī)PCR鑒定

糞便及血液樣品DNA常規(guī)PCR鑒定顯示，糞便6號(hào)、12號(hào)及血液1號(hào)為陰性；其余樣品均為細(xì)小病毒陽(yáng)性，PCR產(chǎn)物1 105bp，與目的基因一致，結(jié)果如圖1。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量方法測(cè)定細(xì)小病毒載量

對(duì)臨床樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)100%。糞便中細(xì)小病毒含量明顯高于血液中病毒含量(最高達(dá)7000倍)，犬糞便中細(xì)小病毒含量最高，貉次之，最后為狐貍(表1)。

2.3 常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較

對(duì)17份樣品分別提取DNA，并進(jìn)行常規(guī)PCR鑒定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度高于常規(guī)PCR，能檢測(cè)出常規(guī)PCR不能檢出的陽(yáng)性臨床樣品(表2)。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法測(cè)定樣品中細(xì)小病毒載量

Table1Detectionofparvovirusloadsinsamplesbyrelativequantificationreal-timePCR

樣品 samplesCt(目標(biāo)基因targetgenes)Ct(內(nèi)參基因referencegenes)△△Ct2-△△Ct糞 便faeces犬dogs125933973-129127707055224313632-111222229212323693750-12918773714貉racoondogs426143468-7643199896525603229-57945547863319340801724313796-127536905444826233583-8712419361928133690-78692338521028463715-7798222486狐foxes1127663804-94837157401232103417-11702250血 液bloods貉racoondogs12746272111380454222262513-19733927324662739-18433587424832801-22864878524422615-08321780

表2常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較

Table2ComparisonoftheconventionalPCRwiththerelativequantificationreal-timePCR

樣 品samples常規(guī)PCRconventionalPCR實(shí)時(shí)熒光定量PCRreal-timePCR糞便faeces犬dogs1+25932+24313+2369貉racoondogs4+26145+25606-33197+24318+26239+281310+2846狐foxes11+276612-3210貉血液Raccoonbloods1-27462+22263+24664+24835+2442

3 討論

細(xì)小病毒性腸炎給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了毛皮動(dòng)物的集約化養(yǎng)殖。檢測(cè)細(xì)小病毒的方法很多，寵物臨床上主要應(yīng)用膠體金試紙條和ELISA檢測(cè)方法，但應(yīng)用于市場(chǎng)上檢測(cè)穩(wěn)定性較低。實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)細(xì)小病毒也有過(guò)相關(guān)報(bào)道。劉海防等[6]研究報(bào)道了所建立的TaqMan熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)小病毒，比普通PCR方法敏感性高100倍。祝文琪等[7]建立的熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)小病毒，最低可達(dá)到10拷貝/μL的陽(yáng)性檢出。

本研究利用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法對(duì)規(guī)?；?dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性達(dá)100%，具有很好的特異性。利用建立的方法檢測(cè)17份臨床樣品，結(jié)果顯示，糞便樣品中病毒載量明顯高于血液樣品。不同動(dòng)物(犬、貉、狐貍)糞便樣品中細(xì)小病毒載量也有較大差異，犬糞便樣品中病毒載量最高，不同貉糞便樣品病毒載量不同。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)小病毒，對(duì)模板DNA的純度要求不高，粗制品DNA也可作為檢測(cè)模板。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)快速、特異性高、重復(fù)性好，在毛皮動(dòng)物細(xì)小病毒性腸炎的臨床診斷上具有較好的應(yīng)用前景。

[1]易立,程世鵬.犬細(xì)小病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].特產(chǎn)研究,2008，(1):71-73.

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[3]張燕,沈茜.一種快速檢測(cè)cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)基因表達(dá)方法的建立[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2003,30(3):474-477.

[4]紀(jì)冬,辛紹杰.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)展和數(shù)據(jù)發(fā)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2009,(4):598-600.

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[6]劉海防,胡傳偉,謝之景,等.犬細(xì)小病毒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,30(5):593-596.

[7]祝文琪,徐衛(wèi)康,陸彥,等.犬細(xì)小病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(5):17-20.