張海玲，張蕾，胡博，白雪，趙建軍，劉昊，徐淑娟，苗立光，馮卓，閆喜軍

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112)

水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)是貓泛白細胞癥病毒(FPV)的變異體，可在腸系膜淋巴結(jié)和隱窩上皮細胞內(nèi)高度復制，是以腸黏膜脫落和腹瀉為特征的急性、烈性、高度接觸性傳染病的病原體[1，2]。在自然條件下，不同品種和不同年齡的水貂均有感染性，但幼貂感染性極強。MEV引起的水貂病毒性腸炎最早于1949年由Schofield報道，1952年由Wills分離、鑒定并命名為水貂腸炎病毒[3，4]。在我國，最早于1981年，由姜廷秀報道。目前，該病蔓延全國。隨著特種養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖的三大疫病之一，給養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[5，6]。

水貂腸炎病毒為單鏈線性DNA病毒，長約5000bp[7，8]，主要編碼VP1、VP2、NS1、NS2 4種蛋白。其中，VP1、VP2為結(jié)構(gòu)蛋白；NS1、NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1蛋白對MEV的復制具有重要調(diào)節(jié)作用。有報道稱，NS1蛋白個別氨基酸的改變可能會影響到細小病毒的細胞嗜性。目前，國內(nèi)尚無對MEV NS1基因的檢測報導。本研究通過對國內(nèi)4個地區(qū)的樣品中MEV NS1基因的克隆測序，初步了解MEV NS1基因的變異特性，為以后對MEV NS1基因的研究及MEV的感染控制提供流行病學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

將遼寧省、吉林省、山東省、河北省采集的發(fā)病致死水貂腸道組織低溫冷凍處理后送至實驗室，無菌加入10倍PBS，研磨，離心取上清液，冷藏待檢。樣品編號及詳細信息見表1。

表111份水貂腸炎病毒陽性樣品采集信息

Table1Informationsof11positivesamplescollectedfromminkenteritisvirus

樣品編號SampleNO．省份Province年份YearsLN(08)1遼寧Liaoning2008LN(08)2遼寧Liaoning2008LN(08)3遼寧Liaoning2008JL(09)1吉林Jilin2009JL(09)2吉林Jilin2009JL(09)3吉林Jilin2009LN(09)1遼寧Liaoning2009LN(09)2遼寧Liaoning2009HB(09)1河北Hebei2009SD(09)1山東Shan?dong2009SD(10)1山東Shan?dong2010

1.2 質(zhì)粒與菌種

大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞和pMD18-TVector(大連寶生物工程有限公司)。

1.3 主要試劑

MiniBEST Viral DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒、PCR 擴增試劑、Marker DL2000(TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(Bioer公司)。

1.4 引物的設計與合成

參照GenBank MEV-B株序列(FJ592174)設計上、下游引物NS-1/NS-2、NS-3/NS-4，分2段測序，引物序列見表2。

表2水貂腸炎病毒NS1基因序列擴增引物

Table2AmplificationprimersofMinkenteritisparvovirusNS1gene

引物編號PrimerNo序列(5′-3′)Sequences退火溫度(℃)ReturntemperatureNS-1CCATAGACCGTTACTGACATTCG53NS-2TACAGCTTGTGCTATGGCTTGAGNS-3AAATGATGGCACAACCAGGAGG56NS-4ACCTGGAGGCACAAGTCCTATAA

1.5 核酸的提取及PCR擴增

按照試劑盒提供的操作手冊從組織樣品研磨上清液中提取DNA。用PCR擴增目的片段。PCR反應體系：10×LATaqbuffer 5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、引物NS-1/NS-2和NS-3/NS-4(50pmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、LATaq酶0.25μL，加去離子水至50μL。PCR反應條件：94℃ 5min；94℃ 45min，54℃ 1min ，72℃ 2min，30個循環(huán)，72℃延伸7min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.6 重組質(zhì)粒的克隆與鑒定

取4.5μL純化產(chǎn)物與0.5μL pMD18-T載體(50ng/μL)進行連接反應，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于Ampicillin抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)后，對單個菌落進行PCR鑒定。陽性菌落接種5mL含Ampicillin的LB營養(yǎng)液中培養(yǎng)增殖，提取質(zhì)粒。用BamHI和HandIII 雙酶切鑒定后，送TaRaKa公司測序。

1.7 序列比對、同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測得的上、下2段序列用DNAstar分子生物學軟件進行拼接，并用DNAstar與GenBank公布的其他細小病毒序列進行比對同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，引用序列見表3。

表3引用參考序列

Table3Referencesequencecitedinthisstudy

編號NO毒株StrainsGenBank登錄號GenBankAccessionNo基因型Genotype國家Country1CPV-bM38245CPV-2USA2CPV-13EU659118CPV-2aUSA3Cpv-2aAJ564427CPV-2aIndia4Fpv-CU-4M38246FPVUSB5MEVBFJ592174MEVChina6cpv-15AY787926CPVUSA7fpv-TU4AB000067FPVJapan8fpv-TU8AB000069FPVJapan9MEVAbashiriD00765MEVJapan10CAENFRA3009FN6695071FPVGermany

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測及NS1基因序列分析

在送檢的32份樣品中檢測出21份陽性樣品，在檢測的幾個地區(qū)中均有陽性樣品分布。每個地區(qū)選取1～3份時間、地點、臨床癥狀有差異的樣品共計11份進行NS1基因的克隆和測序，結(jié)果顯示，NS1基因全長2007bp，編碼668個氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為98.8%～100.0%和98.5%～100%；本次測序序列和國內(nèi)毒株MEVB基因的核苷酸和推導氨基酸序列同源性為98.7%～99.9%和98.7%～99.9%；與國外毒株MEVAbashiri基因的核苷酸和推導氨基酸序列同源性為99.0%～99.5%和98.7%～99.1%。通過對11株肉食獸細小病毒株和已知的9株參考毒株NS1基因氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)有34個氨基酸位點存在變異，見表4。

表4NS1基因變異氨基酸位點

Table4AminoacidvariationsitesofNS1genes.

病毒株StrainsMEVNS1氨基酸變異位點VariationsitesofMEVNS1aminoacid10233340438892128194222227247248249282286350進化分支EvolutionarybranchJL(09)1V----------QI----1JL(09)2V----------QI----1LN(08)1V----------QI----1LN(08)2V--R-R----DQI----1HB(09)1V----------QI----1LN(08)3V-------R--QI----1SD(09)1--G---L--I-------2SD(10)1-----------------2JL(09)3-----------------2LN(09)2-------R---------2LN(09)1V----------QI----3Cpv-13V----------QI----3Cpv-15V----------QI----3Cpv-bV----------QI----3Cpv-2aV----------QIGGQ-3MEVAbashiriV---H-----------N4

續(xù)表4

病毒株StrainsMEVNS1氨基酸變異位點VariationsitesofMEVNS1aminoacid10233340438892128194222227247248249282286350進化分支EvolutionarybranchFpv-CU-4VD---------------5Fpv-TU4V----------------5Fpv-TU8V----------------5病毒株StrainsMEVNS1氨基酸變異位點VariationsitesofMEVNS1aminoacid436443528540543544545572574576585595610616622629662進化分支EvolutionarybranchJL(09)1--NA--E-I----D-Q-1JL(09)2---A--E-I----D-Q-1LN(08)1---A--E-I----D-Q-1LN(08)2---A--E-I----D-Q-1HB(09)1---A--E-I----D-QG1LN(08)3---A--E-I----D-Q-1SD(09)1---A--E-I----DAQ-2SD(10)1---AS-E-IL---D-Q-2JL(09)3---A--E-I---GD-Q-2LN(09)2---A--E-I----D-Q-2LN(09)1-----FE-I--Q-D-Q-3Cpv-13------E-I--Q-D-Q-3Cpv-15------E-I--Q-D-Q-3Cpv-b------E-I--Q-D-Q-3Cpv-2aP----FE-I--Q-D-Q-3MEVAbashiri------E------D-Q-4Fpv-CU-4-V------I----D-Q-5Fpv-TU4-------K--E--D-Q-5Fpv-TU8--------I----D-Q-5

注：MEVB毒株(GenBank登錄號：FJ592174)NS1基因氨基酸序列作為參考序列；“-”.與參考序列相同的氨基酸位點。

Note:Amino acid sequence of the strain MEVB NS1 gene(GenBank accession number:FJ592174)as the reference sequence;“-”.represents the same amino acid position with reference sequence.

2.2 NS1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

本次檢測的11個樣本主要分為3個分支，其中DL1與CPV-2a在同一分支(圖1)。

3 討論

水貂細小病毒、犬細小病毒(CPV)和貓細小病毒進化關(guān)系密切，其中，水貂細小病毒和犬細小病毒都是FPV的突變體[9]。三者在感染時都利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[10]，但是，只有CPV能夠感染貓腎和犬腎細胞，而且FPV和CPV二者宿主范圍的不同主要是由于衣殼蛋白VP2的變異及VP2和犬或貓轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的相互作用[11，12]。

NS1蛋白對細小病毒復制具有重要的調(diào)節(jié)作用，MEV的NS1基因含有1個ORF，全長2 007bp，共編碼668個氨基酸。在細小病毒NS1蛋白中含有1個長約150個氨基酸的保守區(qū)域，這段保守區(qū)域從389位氨基酸開始，并含有391GKRN394保守序列，在不同細小病毒中，這一區(qū)域的氨基酸相似性遠遠高于其他區(qū)域。在這段區(qū)域中含有與ATPase或GTPase相關(guān)的ATP或GTP結(jié)合位點，并具有解旋活性，是病毒DNA復制所必需的。本實驗中所有測序序列均含有391GKRN394保守序列，但JL(09)1株在保守區(qū)域內(nèi)發(fā)生了改變，在528位的D(Asp)到N(Asn)的突變，該處改變是否對NS1的抗原性產(chǎn)生影響，有待于進一步的研究。

MEV最早報道于1949年，CPV最早報道于1978年，雖然報道的時間相差很大，但現(xiàn)在還不能說明他們之間的關(guān)系及進化順序。關(guān)于細小病毒的進化推測最多的就是MEV和CPV由FPLV進化而來。但CPV與MEV之間的親緣關(guān)系較遠。本試驗中檢測的序列獨自分為2支。其中DL1與CPV在同一進化分支，其與CPV的氨基酸同源性高達99.7%，氨基酸位點相對于CPV未發(fā)生特異的改變，其是否顯示了MEV與CPV的NS1基因發(fā)生重組，還有待進一步證實。

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