鄭書榮，郭貴龍，黃奇迪，黃督平，尤捷，黃關立

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

微小RNA-155反義寡核苷酸對乳腺癌MDA-MB-157細胞及裸鼠移植瘤的作用

鄭書榮，郭貴龍，黃奇迪，黃督平，尤捷，黃關立

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

目的：探討微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）對乳腺癌MDA-MB-157細胞增殖、凋亡及裸鼠移植瘤的作用。方法：設計合成化學修飾的miR-155 ASO，通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染MDA-MB-157細胞，激光共聚焦檢測轉(zhuǎn)染率，real-time PCR測定轉(zhuǎn)染后miR-155表達水平的變化，CCK-8法檢測細胞增殖抑制率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，觀察miR-155 ASO對裸鼠成瘤能力的影響，免疫組織化學法檢測瘤體組織Caspase-3的表達。結(jié)果：激光共聚焦檢測轉(zhuǎn)染率達80%以上。轉(zhuǎn)染miR-155 ASO后，miR-155表達明顯下降，細胞增殖能力降低，凋亡增加。miR-155 ASO能明顯抑制裸鼠移植瘤生長，抑制率為52.98%，并且能顯著增加Caspase-3的表達。結(jié)論：miR-155 ASO能顯著下調(diào)miR-155的表達水平，繼而抑制乳腺癌MDA-MB-157細胞的增殖，促進其凋亡；并且通過增加靶基因Caspase-3的表達，抑制裸鼠移植瘤的生長，為miR-155作為乳腺癌治療靶點提供了實驗依據(jù)。

乳腺腫瘤；微小RNA-155；反義寡核苷酸；MDA-MB-157細胞；裸鼠

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為約20～24個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因完全或不完全互補結(jié)合形式來負調(diào)控基因表達，參與調(diào)節(jié)細胞的代謝、增殖、分化和凋亡等基本生理過程[1-2]。諸多研究表明miRNAs的表達異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。乳腺癌是目前威脅婦女健康的最常見惡性腫瘤之一。我們的前期研究已證實miR-155在乳腺癌中呈高表達，并與臨床病理因素顯著相關[3]。本研究選取miR-155高表達的乳腺癌細胞株[4]，運用反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）技術(shù)觀察其對細胞生物學行為的影響，并通過裸鼠致瘤實驗，進一步探討以miR-155為靶點的干預措施對乳腺癌MDA-MB-157細胞成瘤能力的作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料及引物合成MDA-MB-157細胞株購自上海寶特生命科學發(fā)展有限公司，裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（滬）-0005。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自GIBCO公司。miR-155 ASO（5’-ACCCCUAUCAAGAUUAGCAUUAA-3’）和miR-155無義寡核苷酸（scrambled negative control，SCR）（5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’）購自上海GenePharma公司，部分無義寡核苷酸采用羧基熒光素（caboxyfluorescein，F(xiàn)AM）熒光標記。miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，Annexin V-FITC/ PI凋亡檢測試劑盒購自Merck公司，兔抗人多克隆抗體及免疫組織化學試劑盒（BG0023SP）購自上海藍基生物科技有限公司。

1.2 乳腺癌細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺癌細胞。反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染依試劑說明操作。采用無血清培養(yǎng)基分別稀釋miR-155 ASO和miR-155 SCR，然后取與寡核苷酸等體積的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000稀釋到無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻后溫育5 min，再將稀釋的LipofectamineTM2000分別與稀釋的miR-155 ASO或miR-155 SCR混合，輕輕混勻后溫育20 min。將復合物加入到含細胞的培養(yǎng)板中混合，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)，6 h后更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。

1.3 轉(zhuǎn)染率測定將已轉(zhuǎn)染FAM標記無義寡核苷酸的MDA-MB-157細胞避光培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染后8 h激光共聚焦檢測細胞轉(zhuǎn)染率。

1.4 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-155表達水平

MDA-MB-157細胞培養(yǎng)于6孔板中，待其長至70%左右，通過LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染75 nmol/L miR-155 ASO和75 nmol/L miR-155 SCR，轉(zhuǎn)染后6 h換液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作提取MDA-MB-157細胞miRNAs。提取的產(chǎn)物立即按miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成的cDNA第一鏈置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應體系為20μ L，反應條件為94 ℃2 min（，94 ℃ 20 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s）× 40 cycle，具體參照miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書，以5SrRNA為內(nèi)參。計算各標本平均CT值，將目的基因的CT值減去內(nèi)參基因的CT值即為ΔCT。ΔCT越高，其表達越低。miR-155上游引物序列5’-GGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTAA-3’，內(nèi)參5SrRNA上游引物序列5’-GTCTACGGCCATACCACCCT GAAC-3’，通用下游引物由試劑盒提供。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率實驗分6組：空白對照組、脂質(zhì)體組、75 nmol/L SCR組、25 nmol/ L、50 nmol/L和75 nmol/L ASO組。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于每孔加入10μ L的CCK-8試劑，反應1 h，然后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（OD值），各組取均值計算細胞抑制率，細胞增殖抑制率（%）=（1-OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率按凋亡試劑盒說明書操作，以未染色細胞調(diào)零流式細胞儀。實驗分組同步驟1.5。轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞懸液，加入10μ L培養(yǎng)基結(jié)合試劑和1.25μ L Annexin VFITC，室溫避光反應15 min，1 000 g離心5 min，去除培養(yǎng)基。然后用0.5 mL 1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸并加入10 μL Propidium Iodide，立即避光送檢流式。

1.7 裸鼠成瘤實驗裸鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心無菌空氣層流室，全部實驗飼養(yǎng)過程達到無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件。取對數(shù)生長期5×106細胞接種于各裸鼠一側(cè)背部皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。將裸鼠隨機分為4組，每組10只。接種后1周按Li等[5]方法開始處理。實驗分為4組：空白對照組、脂質(zhì)體組、75 nmol/L SCR組、75 nmol/L ASO組。1.8移植瘤的測量及獲取成瘤后每5 d測1次各組裸鼠腫瘤的大小，用游標卡尺測量腫瘤最大長徑（L）和最大橫徑（S），換算成腫瘤的體積V（cm3）= 0.5×L×S2。30 d后，拉頸處死全部裸鼠，取腫瘤觀察并測瘤質(zhì)量，抑瘤率（%）=（對照組瘤質(zhì)量-實驗組瘤質(zhì)量）/對照組瘤質(zhì)量×100%，獲取的腫瘤進行下一步實驗。

1.9 免疫組織化學染色檢測移植瘤Caspase-3表達切片常規(guī)脫蠟、水化、常溫阻斷、抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液后滴加一抗，兔抗Caspase-3多克隆抗體（1:100稀釋），4 ℃過夜，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育20 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，DAB光鏡下顯色、復染、常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。染色結(jié)果采用Soslow等[6]的綜合積分法并稍加改進：①陽性細胞數(shù)計分：無染色細胞為0分、1%～10%為1分、11%～50%為2分、51%～80%為3分、81%～100%為4分；②染色強度計分：胞質(zhì)無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩項乘積即為總分，0分為陰性（-）、1～4分為弱陽性（+）、5～8分為陽性（++）、9～12分為強陽性（+++）。

1.10 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件。兩組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間計量資料比較采用單因素方差分析和LSD多重比較方法進行檢驗；移植瘤Caspase-3表達水平差異采用Kruskal-Wallis H檢驗，組內(nèi)兩兩比較采用Nemenyi法檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-155 ASO轉(zhuǎn)染率測定先轉(zhuǎn)染FAM標記的無義寡核苷酸于MDA-MB-157細胞中，轉(zhuǎn)染8 h后激光共聚焦檢測細胞轉(zhuǎn)染率，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細胞含有熒光，表明轉(zhuǎn)染率可達80%以上。見圖1。

圖1 激光共聚焦檢測轉(zhuǎn)染效果（×200）

2.2 miR-155 ASO抑制miR-155表達miR-155 ASO轉(zhuǎn)染MDA-MB-157細胞48 h后，運用實時定量RT-PCR檢測癌細胞中miR-155的表達水平。從PCR擴增曲線可見miR-155 ASO組CT值明顯高于SCR組（見圖2）。經(jīng)分析兩組Δ CT分別為4.81±0.20和3.04± 0.09，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.13，P=0.002），提示miR-155 ASO能特異性下調(diào)miR-155的表達。

圖2 miR-155 ASO特異性下調(diào)MDA-MB-157細胞中miR-155的表達水平

2.3 細胞生長抑制率檢測結(jié)果與空白對照組相比，脂質(zhì)體組、75 nmol/L SCR組和25 nmol/L ASO組對MDA-MB-157細胞吸光度的影響差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.377、0.289和0.333）。而50 nmol/ L ASO組和75 nmol/L ASO組均可顯著減少MDA-MB-157細胞吸光度（P值分別為0.005和0.000）。單因素方差分析顯示各反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組間OD值改變差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），組內(nèi)分析示ASO濃度從25 nmol/L上升到50 nmol/L時，OD值改變顯著（P=0.032），從50 nmol/L上升到75 nmol/L時，OD值差異亦有統(tǒng)計學意義（P=0.001），表明miR-155 ASO濃度對細胞吸光度的影響呈劑量依賴性?？傮w而言，隨著ASO濃度從25 nmol/L到75 nmol/ L，MDA-MB-157細胞吸光度依次減少，細胞增殖抑制率則從6.26%增加到47.1%。見表1。

表1 CCK-8法檢測miR-155 ASO對MDA-MB-157細胞增殖的影響

2.4 細胞凋亡率檢測結(jié)果隨著miR-155 ASO濃度的增加，其促進MDA-MB-157細胞凋亡的作用逐漸增強?？瞻讓φ战M幾乎未見凋亡細胞，脂質(zhì)體組及75 nmol/L SCR組可見少量凋亡細胞；不同濃度miR-155 ASO處理MDA-MB-157細胞48 h，當濃度達到50nmol/L時，細胞凋亡率達到（28.6±3.77）%，以早期凋亡細胞為主，達（23.7±3.32）%；當miR-155 ASO濃度達到75 nmol/L時，細胞凋亡率達（35.6± 5.96）%，并且晚期凋亡及壞死細胞比例顯著增加，達（12.1±2.32）% ，圖3為其中一次檢測結(jié)果。2.5miR-155 ASO對裸鼠移植瘤生長的影響除空白對照組1只裸鼠未成瘤外，其余裸鼠均成瘤，成瘤率為97.5%。治療期間，各組腫瘤體積均持續(xù)增加，但與另外3組相比，miR-155 ASO組腫瘤生長明顯變緩（見圖4）。由表2可見，miR-155 ASO組腫瘤質(zhì)量明顯較另外3組降低（P=0.000），腫瘤生長明顯受到抑制，抑制率為52.98%。

圖3 miR-155濃度依賴性地促進MDA-MB-157細胞凋亡

圖4 各組裸鼠腫瘤體積及生長曲線

表2 各組裸鼠腫瘤標本平均質(zhì)量和腫瘤抑制率

2.6 移植瘤Caspase-3免疫組織化學檢測細胞胞質(zhì)、胞核呈棕黃色為Caspase-3陽性表達細胞。如圖5所示，空白對照組移植瘤幾乎未見陽性細胞，脂質(zhì)體組和75 nmol/L SCR組可見部分細胞胞質(zhì)呈棕黃色，而75 nmol/L ASO組可見大量細胞呈棕褐色。Kruskal-Wallis H檢驗示各組裸鼠移植瘤Caspase-3陽性表達細胞差異有統(tǒng)計學意義（x2=15.22，P=0.002），Nemenyi法組內(nèi)兩兩比較示75 nmol/L ASO組Caspase-3陽性表達細胞顯著高于其余3組（空白對照組：x2=34.49，P＜0.05；脂質(zhì)體組：x2=9.55，P＜0.05；75 nmol/L SCR組：x2=8.17，P＜0.05）。

3 討論

近年來研究表明，miR-155在人體各種病理生理過程中起著重要的調(diào)控作用，如：炎癥[7]、免疫[8]、造血作用[9]、心血管[10]等疾病及腫瘤。miR-155的突變和異常表達與人體多種腫瘤存在相關性，是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素。我們前期研究表明，miR-155在乳腺癌組織中呈高表達[3]，提示miR-155在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起促癌作用。

圖5 各組裸鼠移植瘤Caspase-3陽性細胞（SP，×400）

腫瘤的首要特征表現(xiàn)為惡性增殖、細胞增殖與凋亡失衡，因此抗增殖、促凋亡是治療腫瘤的有效策略之一。ASO是一類經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達載體，通過堿基互補原理結(jié)合目的基因或mRNA上特定的序列（靶核酸），從而調(diào)節(jié)細胞的生長、分化最終達到基因控制和治療目的[11]。由于反義基因治療具有高度特異性、經(jīng)濟方便及不良反應小等優(yōu)點，現(xiàn)已成為當前腫瘤治療研究熱點之一。目前，有利用針對目的微小RNA的ASO研究miRNAs在細胞中的生物學功能。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-20、miR-106及miR-150 ASO可顯著抑制肺癌細胞A549的增殖并促進其凋亡。Si等[13]觀察到體外乳腺癌細胞株中轉(zhuǎn)染miR-21 ASO后可促進癌細胞的凋亡、抑制其增殖，并且可以抑制裸鼠移植瘤生長。有研究證實miR-155 ASO在淋巴干樣細胞株（lymphoblastoid cell lines，LCLs）中亦有類似作用[14]。

本研究首先探討miR-155對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，選取miR-155高表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-157作為研究對象。將FAM標記的75 nmol/ L miR-155 SCR轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細胞可見綠色熒光標記，表明轉(zhuǎn)染效果達到實驗要求。采用Real-time PCR方法發(fā)現(xiàn)miR-155 ASO可顯著降低MDA-MB-157細胞miR-155的表達水平。CCK-8實驗檢測細胞增殖抑制率結(jié)果提示各ASO組的細胞存活率低于空白對照組，當ASO的濃度達到75 nmol/L時，細胞增殖抑制率顯著增高。應用Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各ASO組細胞凋亡明顯增加。當ASO濃度達到50 nmol/L時，早期凋亡細胞比例明顯增加；濃度達到75 nmol/L時，晚期凋亡及壞死細胞比例顯著增加。以上結(jié)果表明miR-155 ASO可抑制MDAMB-157細胞的增殖并可促進其凋亡。

本研究進一步通過裸鼠致瘤實驗探討了miR-155 ASO在體內(nèi)是否對乳腺癌細胞具有相類似作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理1個月后，miR-155 ASO組裸鼠腫瘤生長較空白對照組、脂質(zhì)體組及SCR組明顯減慢；平均體積及平均質(zhì)量均顯著低于另外3組（P＜0.05）。表明miR-155 ASO在體內(nèi)可有效抑制腫瘤的生長，提示miR-155的高表達可能促進乳腺癌細胞增殖，與Zhu等[3]研究發(fā)現(xiàn)一致。

細胞凋亡是一個由Caspase家族成員介導的復雜的蛋白酶級聯(lián)反應過程。在Caspase家族中，Caspase-2、8、9、10等處于上游，Caspase-3、6、7處于下游，其中Caspase-3、7是細胞凋亡最后的共同途徑。與多數(shù)蛋白酶一樣，Caspases以無活性的酶原形式存在，細胞凋亡是由Caspases酶原的活化而引發(fā)的。Caspases的激活通過級聯(lián)反應模式，即相關信號蛋白激活Caspases-8，引起Caspases級聯(lián)反應，最后激活Caspascs-3，其作為細胞凋亡的最后執(zhí)行者，是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，是所有凋亡途徑的最后效應子，它激活DNA酶，裂解DNA成碎片，導致細胞凋亡。

為了探討miR-155 ASO促進腫瘤細胞凋亡的可能作用機制，本研究通過免疫組化檢測各組裸鼠移植瘤中Caspase-3的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)空白對照組移植瘤幾乎未見Caspase-3蛋白表達，SCR組和脂質(zhì)體組可見少量陽性細胞表達，而ASO組可見大量Caspase-3陽性表達細胞。Caspase-3作為細胞凋亡中最關鍵的酶，其活化表達將引起細胞不可逆的凋亡，是細胞凋亡的標志[15]，提示miR-155 ASO可通過上調(diào)Caspase-3的表達而誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤的作用。Wang等[16]研究腰椎間盤變性時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-155可降低Caspase-3的表達，而敲除miR-155則可上調(diào)Caspase-3表達，進一步通過雙熒光素酶報告顯示Caspase-3為miR-155的靶基因之一。

綜上所述，miR-155 ASO可抑制乳腺癌MDA-MB-157細胞的增殖、促進其凋亡，并且抑制裸鼠移植瘤的生長。利用miR-155 ASO有可能成為治療乳腺癌的一個新的研究方向。

[1]Ambros V. MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing[J]. Cell, 2003, 113(6): 673-676.

[2]Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009, 136(2): 215-233.

[3]Zhu J, Hu XQ, Guo GL, et al. Expression and its clinical significance of miR-155 in human primary breast cancer[J].Zhong Hua Wai Ke Za Zhi, 2010, 48(3): 205-208.

[4]Kong W, He L, Coppola M, et al. MicroRNA-155 regulates cell survival, growth, and chemosensitivity by targeting FOXO3a in breast cancer[J]. J Biol Chem, 2010, 285(23): 17869-17879.

[5]Li J, Huang H, Sun L, et al. MiR-21 indicates poor prognosis in Tongue Squamous Cell Carcinomas as an apoptosis inhibitor[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(12): 3998-4008.

[6]Soslow RA, Dannenberg AJ, Rush D, et al. Cox-2 is expressed in human pulmonary, colonic, and mammary tumors[J]. Cancer , 2000, 89(12): 2637-2645.

[7]Bhattacharyya S, Balakathiresan NS, Dalgard C, et al. Elevated miR-155 promotes inflammation in cystic fibrosis by driving hyperexpression of interleukin-8[J]. J Biol Chem, 2011, 286(13): 11604-11615.

[8]O'Connell RM, Taganov KD, Boldin MP. MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(5): 1604-1609.

[9]O'Connell RM, Rao DS, Chaudhuri AA, et al. Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloproliferative disorder[J]. J Exp Med, 2008, 205(3): 585-594.

[10]Urbich C, Kuehbacher A, Dimmeler S. Role of microRNAs in vascular diseases, inflammation, and angiogenesis[J]. Cardiovasc Res , 2008, 79(4): 581-588.

[11]Stein CA, Cheng YC. Antisense oligonucleotides as therapeutic agents-is the bullet really magical[J]. Science, 1993, 261(5124): 1004-1012.

[12]Wang PY, Li YJ, Zhang S, et al. Regulating A549 cells growth by ASO inhibiting miRNA expression[J]. Mol Cell Biochem, 2010, 339(1-2): 163-171.

[13]Si ML, Zhu S, Wu H, et al. miR-21-mediated tumor growth [J]. Oncogene, 2007, 26(19): 2799-2803.

[14]Linnstaedt SD, Gottwein E, Skalsky RL, et al. Virally induced cellular microRNA miR-155 plays a key role in B-cell immortalization by Epstein-Barr virus[J]. J Virol, 2010, 84 (22): 11670-11678.

[15]Porter AG, J?nicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death Differ, 1999, 6(2): 99-100.

[16]Wang HQ, Yu XD, Liu ZH, et al. Deregulated miR-155 promotes Fas-mediated apoptosis in human intervertebral disc degeneration by targeting FADD and caspase-3[J]. J Pathol, 2011, 225(2): 232-242.

（本文編輯：吳健敏）

Effects of antisense oligonucleotide targeting microRNA-155 on breast carcinoma cell line MDA-MB-157

and the implanted tumor in nude mice

ZHENG Shurong, GUO Guilong, HUANG Qidi, HUANG Duping,YOU Jie, HUANG Guanli.Department of Oncological Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To explore the effects of antisense oligonucleotide targeting miR-155 on proliferation and apoptosis in MDA-MB-157 cells and the growth of implanted tumor in nude mice.Methods:2’Ome modified antisense oligodeoxynucleotide targeting miR-155 was synthesized and then transfected into MDAMB-157 cells by LipofectamineTM2000. Transfection efficiency was detected by laser confocal microscope. Realtime RT-PCR method was used to detect the expression of miR-155. Cell counting Kit-8 (CCK-8) assay was used to detect the proliferation of MDA-MB-157 cells and cell apoptosis rate was measured by flow cytometry. The effects of miR-155 Antisense oligonucleotide (miR-155 ASO) on the transplanted tumor were assessed in nude mice.Results:Transfection efficiency detected by laser confocal microscope was higher than 80%. The level of miR-155 expression was significantly decreased (P<0.05) in the cells transfected with miR-155 ASO, compared with that in cells transfected with negative control. After being transfected with miR-155 ASO, the viability of MDA-MB-157 cells reduced greatly (P<0.05) and the number of apoptotic cells increased significantly. Additionally, miR-155 ASO inhibited the growth of transplanted tumor in vivo (inhibition ratio=52.98%) and significantly increased the expression of caspase-3.Conclusion:miR-155 ASO can effectively down-regulate the expression of miR-155, induce cell apoptosis and inhibit cell proliferation and tumor growth by increasing the expression of caspase-3. These findings provide the experimental evidence for using miR-155 as a therapeutic target of breast carcinoma.

breast neoplasms; microRNA-155; antisense oligonucleotide; MDA-MB-157 cells; nude mice

R73

A

1000-2138（2014）03-0183-06

2013-03-19

鄭書榮（1985-），男，浙江泰順人，住院醫(yī)師，碩士。

郭貴龍，主任醫(yī)師，碩士生導師，Email：guogui long@sina.com。