張瑾，劉素霞，王倩

（1.麗水市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江 麗水 323000；2.麗水市人民醫(yī)院 檢驗科，浙江 麗水 323000）

·論 著·

Ecdysoneless在胃癌組織中的表達及其意義

張瑾1，劉素霞1，王倩2

（1.麗水市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江 麗水 323000；2.麗水市人民醫(yī)院 檢驗科，浙江 麗水 323000）

目的：探討ecdysoneless（ECD）在胃癌中的表達及其與腫瘤病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。方法：Real-time PCR法檢測56例胃癌組織及其對應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織中的ECD mRNA表達水平；免疫組化法檢測100例胃癌組織中ECD蛋白的表達情況，分析ECD蛋白表達與胃癌病理參數(shù)及預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果：PCR結(jié)果顯示ECD mRNA在胃癌組織中較癌旁正常胃黏膜組織中表達增高。100例胃癌組織中54例（占54.0%）ECD蛋白陽性表達。胃癌組織中ECD表達與腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、組織學(xué)類型無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，ECD表達陽性組的平均生存時間為（35.8±1.9）月，顯著低于陰性組的（45.2± 1.9）月（P＜0.01）；ECD表達陽性組的五年生存率為24.1%（13/54），低于陰性組的50.0%（23/46）（P＜0.01）。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期、Lauren分型可以作為胃癌的獨立預(yù)后因子（P＜0.05），而ECD表達不能作為胃癌的一個獨立預(yù)后因子（P=0.212）。結(jié)論：ECD在胃癌中表達增高，其表達水平與Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，且其高表達與胃癌預(yù)后相關(guān)。

胃腫瘤；ecdysoneless；預(yù)后

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是世界腫瘤第二大死亡原因[1]，其發(fā)生、發(fā)展受多基因調(diào)控[2]。近年來隨著分子生物學(xué)發(fā)展，越來越多的蛋白質(zhì)分子生物標(biāo)記物應(yīng)用于惡性腫瘤的預(yù)后判斷。Ecdysoneless（ECD）是新近發(fā)現(xiàn)的一個細胞周期調(diào)節(jié)基因，與細胞增殖、分化，以及細胞周期進展具有密切關(guān)系。報道稱ECD在胰腺癌和乳腺癌的癌組織中呈高表達，并預(yù)示不良預(yù)后[3-4]，但其在胃癌中的表達情況鮮有報道。本研究通過Real-time PCR法檢測ECD mRNA在胃癌組織及癌旁非腫瘤組織中的表達情況，并用免疫組織化學(xué)（以下簡稱免疫組化）法檢測ECD蛋白在胃癌組織中的表達情況，探討其與胃癌病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料收集麗水市中心醫(yī)院2001-2004年胃癌患者100例石蠟樣本，所有病例均經(jīng)病理證實，且術(shù)前未經(jīng)任何放、化療。其中男60例，女40例，男女比例為3:2；平均年齡58.23歲（31～80歲）。所有病例隨訪5年以上，生存期的計算從手術(shù)日期到隨訪截止日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。腫瘤組織根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2010年第七版）進行病理分期，其他分型標(biāo)準(zhǔn)參見WHO分類（2000）胃癌部分。100例按分化程度分為高分化1例，中分化29例，低分化70例；按組織學(xué)類型分為乳頭狀腺癌5例，管狀腺癌72例，黏液腺癌5例，印戒細胞癌18例；按淋巴轉(zhuǎn)移分為無淋巴轉(zhuǎn)移組32例，有淋巴轉(zhuǎn)移組68例；TNM分期I期23例，I I期20例，I I I期38例，I V期19例。取胃鏡正常黏膜組織做ECD免疫組化對照。

另外收集56份新鮮的胃癌組織及其配對的正常胃黏膜組織手術(shù)樣本，其中男33例，女23例，年齡32～69歲，中位年齡為52歲。Real-time PCR法分析檢測ECD mRNA在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況。所有病例均經(jīng)病理證實，術(shù)前未經(jīng)放、化療，均經(jīng)患者及家屬知情同意。標(biāo)本均于手術(shù)后立即取材，-86 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑ECD小鼠抗人單克隆抗體（sc-81860，Santa Cruz，美國）、Histostain-Plus kits LABSA Detection System免疫組化試劑盒（85-9043，Invitrogen，美國）和DAB顯色液（Dako，美國）購自杭州言科生物技術(shù)有限公司。Trizol試劑、Reverse Transcription Systems反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR047A）及SYBR熒光定量試劑盒（DRR420A）購自Takara公司。ECD及內(nèi)參GAPDH基因PCR引物采用Primer5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物公司合成。

1.3 Real-time PCR檢測ECD mRNA表達取約3 mg新鮮組織，液氮研磨，收集組織粉末，采用Trizol細胞裂解法提取組織樣本總RNA，按說明書進行操作。利用核酸定量分析儀（ND-2000，美國Gene公司）檢測總RNA純度和濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書采用隨機引物法合成cDNA。用GAPDH作為內(nèi)參照在Mx3000p熒光定量PCR儀上，利用miScript SYBR Green PCR試劑盒進行熒光定量PCR反應(yīng)。ECD引物序列：上游：5’-ACTTTGAAACACACGAACCTGGCG-3’，下游5’-TGATGCAGGTGTGTGCTAGTTCCT-3’；GAPDH引物序列：上游：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；在延伸結(jié)束后進行熒光采集，進行40個循環(huán)，最后72 ℃維持10 min。采用2-△CT法分析各個樣本中ECD相對于內(nèi)參GAPDH的相對表達量。

1.4 免疫組化染色及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，枸櫞酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)3 min，3% H2O2孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%正常羊血清室溫下封閉15 min，滴加小鼠抗人的ECD單克隆抗體（1:200稀釋），4 ℃過夜，滴加生物素化標(biāo)記的二抗，室溫20 min，PBS洗滌3次后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物，室溫20 min。PBS洗滌3次后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。同時，以PBS代替一抗作為陰性對照。

ECD蛋白表達情況根據(jù)染色強度和染色細胞百分率進行評定和分析，陽性細胞占計數(shù)細胞的百分率：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；染色強度：無色為0分，淡黃色，即弱陽性為1分，棕黃色，即中等染色強度為2分，棕褐色，即強陽性為3分；兩者計分相乘即得出。最后得分：0為無表達，1～3為可疑表達，4～6為弱表達，7～12為強表達。最終統(tǒng)計分析時將0～3合并為陰性表達，4～12為陽性表達。結(jié)果的判斷均采用統(tǒng)一評分標(biāo)準(zhǔn)和雙盲法由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師來判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0軟件進行分析，ECD mRNA在胃癌及其配對正常胃黏膜組織的相對表達量比較采用配對t檢驗；ECD蛋白陽性表達率與病理參數(shù)之間的相關(guān)性行x2檢驗；生存率分析采用Kaplan-Meier法并做Log-rank檢驗；多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECD mRNA在胃癌組織和正常胃黏膜中的表達

檢測結(jié)果顯示，腫瘤組織中的ECD mRNA相對表達量為0.47±0.050，明顯高于正常胃黏膜組織的0.27±0.030，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.761，P=0.0004）。詳見圖1。

2.2 胃癌中ECD蛋白的表達與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系免疫組化染色結(jié)果顯示ECD在腫瘤細胞的細胞核及細胞漿中均有表達，而正常胃黏膜組織中除少量炎癥細胞有表達外，胃黏膜細胞ECD均表達陰性（見圖2）。

圖1 胃癌及正常胃黏膜組織中ECD mRNA的相對表達量

圖2 ECD在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達

胃癌組織中ECD的陽性率為54.0%（54/100）。胃癌組織中ECD表達與腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、組織類型無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)（見表1）。Cox多元回歸分析結(jié)果顯示TNM分期、Lauren分型可以作為胃癌獨立預(yù)后的因子（P＜0.05），而ECD表達不能作為胃癌的一個獨立預(yù)后因子（P=0.212）（見表2）。

2.3 ECD蛋白表達與胃癌預(yù)后的關(guān)系進一步進行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示ECD蛋白表達陽性組的平均生存時間為（35.8±1.9）月，顯著低于陰性組的（45.2±1.9）月（P＜0.01）；ECD蛋白表達陽性組的五年生存率為24.1%（13/54），低于陰性組的50.0%（23/46）（P＜0.01）。生存曲線見圖3。

3 討論

ECD基因最初是從果蠅的無退化蛋白（ecdysoneless）突變體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，這種突變導(dǎo)致果蠅胚胎中蛻皮激素水平下降，從而使果蠅胚胎發(fā)育停滯于第二個幼蟲齡期階段[5]。雖然ECD基因發(fā)現(xiàn)已經(jīng)近40年了，但是ECD基因所落在基因區(qū)編碼的蛋白分子產(chǎn)物直到最近幾年才被證實，這種基因突變產(chǎn)物可以導(dǎo)致除生殖和發(fā)育缺陷之外的一些細胞生存缺陷，不過促成這些生存缺陷的生物化學(xué)機制尚不明確[6]。Sato等[7]和Kainou等[8]研究發(fā)現(xiàn)ECD基因在酵母中可能與糖酵解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，是Schizosaccharomyces pombe（粟酒裂殖酵母）生長和生存的必需基因，但是它的功能及作用機制仍不清楚。Kim等[9]在對小鼠胚胎成纖維細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ECD能夠與E2F競爭性地和磷酸化的Rb相結(jié)合，因此敲除ECD表達可能通過Rb-E2F通路，使小鼠胚胎成纖維細胞發(fā)生增殖停滯和G1-S細胞周期阻滯。Zhang等[10]等研究發(fā)現(xiàn)ECD基因表達能夠與P53基因相互作用并且使其表達穩(wěn)定，上調(diào)ECD表達能夠增強P53相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此他們提出ECD影響細胞生存和增殖可能與P53通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)ECD在正常胰腺組織中不表達，但是在胰腺癌及遠處轉(zhuǎn)移組織中呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)；體外細胞及裸鼠體內(nèi)實驗顯示，下調(diào)ECD表達能夠顯著抑制胰腺癌細胞增殖及體外成瘤能力；基因芯片分析結(jié)果顯示，ECD可能通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝相關(guān)基因GLUT4，影響腫瘤細胞糖分攝取，從而起到影響腫瘤細胞增殖的作用[11]。Zhao等[12]對104例乳腺導(dǎo)管腺癌和954例乳腺癌進行免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，ECD在乳腺癌中表達增高，其表達與腫瘤分期、分化程度以及增殖有關(guān)，生存分析顯示ECD高表達預(yù)后較差，且與HER2表達相關(guān)，可以作為乳腺癌的一個預(yù)后評判指標(biāo)。以上研究顯示ECD表達與腫瘤進展可能存在一定關(guān)系，但是其具體作用分子機制研究仍處于起步階段。

表1 ECD表達與病理參數(shù)之間的關(guān)系

表2 Cox多因素回歸分析結(jié)果

圖3 生存曲線分析

本實驗通過Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)相對于正常胃黏膜組織，胃癌組織中ECD的表達增高。免疫組化結(jié)果顯示ECD在胃癌組織中陽性表達率為54.0%，進一步統(tǒng)計分析結(jié)果顯示其表達水平與Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、遠處轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，ECD蛋白表達陽性組患者的平均生存時間顯著低于陰性組，且ECD蛋白表達陽性組的五年生存率顯著低于陰性組。以上結(jié)果提示ECD高表達與胃癌預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，ECD蛋白的表達增高可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與其促進胃癌進展及轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。進一步深入研究ECD蛋白及其編碼基因與胃癌的關(guān)系，對揭示胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移機制和探尋更為有效的治療手段具有重要意義。

[1]Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

[2]周宏眾, 韓少良, 余作黔, 等. p73和COX-2在胃腺癌的表達及其預(yù)后意義[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2008, 38(6): 541-543.

[3]Zhao X, Mirza S, Alshareeda A, et al. Overexpression of a ovel cell cycle regulator ecdysoneless in breast cancer: a marker of poor prognosis in HER2/neu-overexpressing breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 134(1): 171-180.

[4]Dey P, Rachagani S, Chakraborty S, et al. Overexpression of ecdysoneless in pancreatic cancer and its role in oncogenesis by regulating glycolysis[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(22): 6188-6198.

[5]Garen A, Kauvar L, Lepesant JA. Roles of ecdysone in Drosophila development[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1977, 74 (11): 5099-5103.

[6]Gaziova I, Bonnette PC, Henrich VC, et al. Cell autonomous roles of the ecdysoneless gene in drosophila development and oogenesis[J]. Development, 2004, 131(11): 2715-2725.

[7]Sato T, Jigami Y, Suzuki T, et al. A human gene, hSGT1, can substitute for GCR2, which encodes a general regulatory factor of glycolytic gene expression in saccharomyces cerevisiae [J]. Mol Gen Genet, 1999, 260(6): 535-540.

[8]Kainou T, Shinzato T, Sasaki K, et al. Spsgt1, a new essential gene of schizosaccharomyces pombe, is involved in carbohydrate metabolism[J]. Yeast, 2006, 23(1): 35-53.

[9]Kim JH, Gurumurthy CB, Naramura M, et al. Role of mammalian ecdysoneless in cell cycle regulation[J]. J Biol Chem, 2009, 284(39): 26402-26410.

[10]Zhang Y, Chen J, Gurumurthy CB, et al. The human orthologue of drosophila ecdysoneless protein interacts with p53 and regulates its function[J]. Cancer Res, 2006, 66(14): 7167-7175.

[11]Dey P, Rachagani S, Chakraborty S, et al. Overexpression of ecdysoneless in pancreatic cancer and its role in oncogenesis by regulating glycolysis[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(22): 6188-6198.

[12]Zhao X, Mirza S, Alshareeda A, et al. Overexpression of a novel cell cycle regulator ecdysoneless in breast cancer: a marker of poor prognosis in HER2/neu overexpressing breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 134(1): 171-180.

（本文編輯：丁敏嬌）

Expression and significance of ecdysoneless in gastric cancer

ZHANG Jin1, LIU Suxia1, WANG Qian2.

1.Department of Medical Laboratory, Lishui Central Hospital, Lishui, 323000; 2.Department of Medical Laboratory, Lishui People's Hospital, Lishui, 323000

Objective: To probe the ecdysoneless (ECD) expression and its correlation with clinical variables, such as clinical pathologic factors and prognosis in gastric cancer.Methods:ECD mRNA expression level in gastric cancer samples and matched normal gastric tissue from 56 patients was detected using Real-time PCR method. Immunohistochemical method was adopted to deteced the protein expression level of ECD in gastric cancer tiusse which with 5 years follow up.Results:ECD expression was up-regulated in gastric cancer tiusse compared with matched normal gastric tissue. Positive ECD immunoreactivity was seen in 54.0% of gastric cancer specimens, which was correlated with Lauren typing, lymph node metastasis, vessel invasion, distant metastasis, and TNM stage (P<0.05). Compared with ECD negative patients, ECD positive patients had significantly shorter survival times (35.8±1.9 month vs 45.2±1.9 month, P<0.01) and short survival rate (24.1% vs 50.0%, P <0.01). Multiariable COX regression analysis indicated that Lauren typing and TNM stage could serve as a dependent prognsis factor of gastric cancer (P<0.01), except ECD expression (P=0.212).Conclusion:ECD expression is increased in gastric cancer tissue. The ECD expression correlates with Lauren typing, lymph node metastasis, vessel invasion, distant metastasis, and TNM stage and poor survival rate in gastric cancer.

stomach neoplasms; ecdysoneless; prognosis

R735.2

A

1000-2138（2014）02-0117-05

2013-04-23

張瑾（1982-），女，浙江麗水人，檢驗師。