許踐剛，林峰，張憲波，胡芝，王昭君，趙挺，沈潔

（1.溫州市中心醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺(tái)州 318020；3.溫州市中心醫(yī)院 婦瘤科，浙江 溫州 325000）

·論 著·

miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義

許踐剛1，林峰2，張憲波1，胡芝3，王昭君1，趙挺1，沈潔2

（1.溫州市中心醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺(tái)州 318020；3.溫州市中心醫(yī)院 婦瘤科，浙江 溫州 325000）

目的：探討miR-195在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周血漿中的表達(dá)及其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法：以miR-16為內(nèi)參，采用莖環(huán)RT-qPCR方法檢測48例術(shù)前、術(shù)后2周乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及35例健康對照者血漿中miR-195的表達(dá)，并分析其表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果：乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血漿中miR-195的表達(dá)較健康對照者明顯升高（P＜0.05），術(shù)后2周表達(dá)明顯降低至健康對照者水平。ROC曲線顯示，血漿miR-195評價(jià)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的敏感性和特異性可達(dá)94.4%和68.8%。與臨床特征相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)未見血漿miR-195表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫塊大小、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等臨床病理特征有明顯相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論：血漿中miR-195的異常表達(dá)可作為乳腺癌診斷的新的腫瘤標(biāo)志物。

微RNAs；miR-195；乳腺腫瘤

近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性微RNA，即microRNA（miRNA），長度只有22 nt左右，不編碼任何蛋白質(zhì)，但能夠高效調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達(dá)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。除外細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在血清、眼淚、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、羊水等體液均可檢測到miRNA[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞外miRNA可通過exosome轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)[2-5]，因此被認(rèn)為是非常理想的腫瘤早期診斷和篩查、治療效果判斷、預(yù)后評價(jià)的手段。最近有報(bào)道稱miR-195的失調(diào)表達(dá)不但與腎上腺皮質(zhì)腫瘤[6]、結(jié)腸癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]等相關(guān)，而且與乳腺癌[10-11]相關(guān)。但血漿miR-195表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系鮮有研究。為此，本研究通過莖環(huán)RT-qPCR方法比較乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及健康對照者血漿標(biāo)本中miR-195的表達(dá)，并分析其術(shù)后2周時(shí)表達(dá)的變化及其與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料48例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌術(shù)前及術(shù)后2周血漿標(biāo)本采自2011年1月至2012年11月間溫州市中心醫(yī)院腫瘤外科及臺(tái)州市第一人民醫(yī)院普外科住院患者。所有患者均為女性，年齡31～78歲，平均（52.2±11.5）歲。所有患者均經(jīng)病理確診，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織病理的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO乳腺腫瘤的病理學(xué)分類。雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）的免疫組化判斷參照美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）與美國病理家學(xué)會(huì)（CAP）的檢測指南。

1.2 材料Tri-Reagent BD試劑購自Sigma公司；ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Mastermix等試劑購自Toyobo公司；DEPC水購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血漿收集：取枸櫞酸鈉抗凝的外周靜脈血5 mL，3 000 r/min、離心10 min，取血漿，進(jìn)一步12 000 r/min、離心10 min后，將血漿置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)收集同時(shí)期年齡匹配的、無腫瘤病史的健康對照者35例，同樣方法收集血漿備用。

1.3.2 血漿RNA提?。喝⊙獫{標(biāo)本200 μL，加入1 μL 5 mg/mL糖原、20 μL 5 mol/L的冰醋酸及750μL的TRI Regent BD，充分混勻，按試劑說明書步驟抽提RNA。RNA沉淀經(jīng)80%乙醇洗滌后，加入DEPC處理水20μL，-80 ℃保存。

1.3.3 miR-195表達(dá)檢測：根據(jù)Wu等[9]報(bào)道的miRNA檢測的莖環(huán)RT-qPCR方法，以miR-16作為內(nèi)參，分析miR-195表達(dá)。相關(guān)分析的引物序列如表1所示。取5μL提取的RNA分別以miR-195及miR-16莖環(huán)RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存。以15μL反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time定量PCR。miRNA檢測反應(yīng)體系包括：1 μL RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特異前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。Realtime定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。Real-time定量PCR技術(shù)使用Applied Biosystems 7500儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以miR-16作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示標(biāo)本中miR-195相對表達(dá)量，其中△Ct=CtmiR-195-CtmiR-16。以N=2-△△Ct表示手術(shù)后2周血漿miR-195表達(dá)相對于術(shù)前血漿標(biāo)本的變化倍數(shù)，其中△△Ct=（CtmiR-195-CtmiR-16）術(shù)后-（CtmiR-195-CtmiR-16）術(shù)前。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。miR-195表達(dá)數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。配對樣本間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)，兩組獨(dú)立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，ROC曲線分析敏感性和特異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿miR-16及miR-195檢測特異性分析如圖1顯示，miR-16及miR-195的RT-PCR產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，說明莖環(huán)RT-qPCR可以特異檢測miR-16及miR-195。

2.2 miR-195在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中的表達(dá)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中miR-195表達(dá)結(jié)果如圖2所示，提示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前血漿miR-195表達(dá)明顯高于健康對照者（P＜0.001），術(shù)后2周明顯降低（P＜0.001）。術(shù)后2周與健康對照者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其相對表達(dá)值分別為：5.12、2.20及2.66。

圖1 miR-195及miR-16莖環(huán)RT-qPCR熔解曲線

圖2 乳腺癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中miR-195表達(dá)水平

2.3 血漿miR-195作為乳腺癌患者篩選指標(biāo)的評價(jià)

基于上述結(jié)果，我們進(jìn)一步采用ROC曲線分析血漿miR-195表達(dá)篩選乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的特異性和敏感性。如圖3所示，比較乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及健康對照者血漿miR-195表達(dá)的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.884（95% CI=0.815～0.952，P＜0.001），提示血漿miR-195可作為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的篩選指標(biāo)。以血漿miR-195相對表達(dá)量4.26作為評價(jià)臨界值判斷乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的敏感性和特異性分別為94.4%和68.8%。

圖3 ROC曲線分析乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血漿miR-195的表達(dá)

2.4 血漿miR-195表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析血漿中表達(dá)上調(diào)的miR-195的相對表達(dá)量和腫瘤大小，ER、PR、Her-2狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，血漿miR-195的表達(dá)水平與這些臨床病理特征無明顯相關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2 血漿miR-195表達(dá)和乳腺癌臨床病理因素的相關(guān)性分析

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展也是一個(gè)多基因改變的過程，同樣接受miRNA的調(diào)控作用。而腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤組織和細(xì)胞產(chǎn)生的與腫瘤形成、發(fā)生相關(guān)的物質(zhì)，一種良好的腫瘤標(biāo)志物對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，判斷療效及預(yù)后等方面均有重要的意義。來自血液中的腫瘤標(biāo)志物因其無創(chuàng)、高效尤其適用于臨床。近年來已發(fā)現(xiàn)許多與來自于腫瘤細(xì)胞本身的與乳腺癌TMN分期、血管侵犯、增殖指數(shù)、ER和/或PR狀態(tài)等預(yù)后因子相關(guān)的miRNA[12-13]，最近還發(fā)現(xiàn)miRNA可穩(wěn)定存在于血清和血漿中[1]。為此，使用循環(huán)miRNA作為潛在的早期腫瘤篩選標(biāo)記引起了人們的極大的興趣。最近的一些病例對照研究[14-17]發(fā)現(xiàn)了一些乳腺癌血液特征的miRNA。

miR-195屬于miR-15家族成員，基因位于17p13.1區(qū)域，與miR-497成簇分布。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織miR-195表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤關(guān)系密切。最近基于全血miRNA研究證明，乳腺癌患者全血系統(tǒng)的miR-195表達(dá)明顯高于健康對照者[18]，而且與前列腺癌、腎癌、結(jié)腸癌等比較，全血系統(tǒng)miR-195是乳腺癌具有相對特征性的miRNA[19]。但血漿miR-195的表達(dá)與乳腺癌臨床特征關(guān)系少有研究報(bào)道。

為分析miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義，本研究以miR-16為內(nèi)參，應(yīng)用莖環(huán)RT-qPCR技術(shù)檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中miR-195表達(dá)。與全血檢測結(jié)果類似，本研究乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血漿miR-195表達(dá)明顯高于健康對照者。而且我們還發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)后2周血漿miR-195降低到健康對照者的水平。ROC曲線顯示血漿中miR-195的異常表達(dá)有較好的乳腺癌診斷價(jià)值，其敏感性和特異性可達(dá)94.4%和68.8%。但與臨床病理特征相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)未見血漿miR-195表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫瘤大小、ER、PR、Her-2狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等乳腺癌的臨床病理因素有明顯相關(guān)。

研究已證實(shí)，游離的miRNA容易被RNA酶降解，血漿中的miRNA主要通過外分泌泡（exosome）、Ago2蛋白、高密度脂蛋白等不同載體運(yùn)輸[20]，但循環(huán)miRNA的起源迄今尚未完全闡明，曾經(jīng)被認(rèn)為來源于循環(huán)腫瘤細(xì)胞[21]、血液中血細(xì)胞[22]或疾病部位組織細(xì)胞[23]等。研究已經(jīng)表明miR-195在乳腺癌組織中低表達(dá)[10]，而全血[18]及本研究的血漿中miR-195的檢測結(jié)果是明顯上調(diào)，提示乳腺癌患者血漿miR-195可能不是起源于腫瘤組織，其來源有待于進(jìn)一步研究確定，但這并不影響其作為一種乳腺浸潤性導(dǎo)管癌血液學(xué)腫瘤標(biāo)志物的良好潛質(zhì)。

[1]Weber JA, Baxter DH, Zhang S, et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids[J]. Clin Chem, 2010, 56(11): 1733-1741.

[2]Iguchi H, Kosaka N, Ochiya T. Secretory microRNAs as a versatile communication tool[J]. Commun Integr Biol, 2010, 3(5): 478-481.

[3]Iguchi H, Kosaka N, Ochiya T. Versatile applications of microRNA in anti-cancer drug discovery: from therapeutics to biomarkers[J]. Curr Drug Discov Technol, 2010, 7(2): 95-105.

[4]Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, et al. Competitive interactions of cancer cells and normal cells via secretory microRNAs[J]. J Biol Chem, 2012, 287(2): 1397-1405.

[5]Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, et al. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells [J]. J Biol Chem, 2010, 285(23): 17442-17452.

[6]Soon PS, Tacon LJ, Gill AJ, et al. miR-195 and miR-483-5p Identified as Predictors of Poor Prognosis in Adrenocortical Cancer[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(24): 7684-7692.

[7]Liu L, Chen L, Xu Y, et al. microRNA-195 promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity of human colorectal cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 400 (2): 236-240.

[8]Yang X, Yu J, Yin J, et al. MiR-195 regulates cell apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells by targeting LATS2 [J]. Pharmazie, 2012, 67(7): 645-651.

[9]Wu WY, Xue XY, Chen ZJ, et al. Potentially predictive microRNAs of gastric cancer with metastasis to lymph node [J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(31): 3645-3651.

[10]Li D, Zhao Y, Liu C, et al. Analysis of MiR-195 and MiR-497 expression, regulation and role in breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(7): 1722-1730.

[11]Yang G, Wu D, Zhu J, et al. Upregulation of miR-195 increases the sensitivity of breast cancer cells to Adriamycin treatment through inhibition of Raf-1[J]. Oncol Rep, 2013, 30(2): 877-889.

[12]Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J]. Cancer Res, 2005, 65(16): 7065-7070.

[13]Mattie MD, Benz CC, Bowers J, et al. Optimized highthroughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies[J]. Mol Cancer, 2006, 5(1): 24.

[14]Asaga S, Kuo C, Nguyen T, et al. Direct serum assay for microRNA-21 concentrations in early and advanced breast cancer[J]. Clin Chem, 2011, 57(1): 84-91.

[15]van Schooneveld E, Wouters MC, Van der Auwera I, et al. Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers[J]. Breast Cancer Res, 2012, 14(1): R34.

[16]Wu Q, Wang C, Lu Z, et al. Analysis of serum genome-wide microRNAs for breast cancer detection[J]. Clin Chim Acta, 2012, 413(13-14): 1058-1065.

[17] 黃關(guān)立, 薛向陽, 曾瑞超, 等. 乳腺癌患者血漿中相關(guān)microRNA的表達(dá)及其臨床意義[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 43(5): 286-290.

[18]Heneghan HM, Miller N, Lowery AJ, et al. Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer[J]. Ann Surg, 2010, 251(3): 499-505.

[19]Heneghan HM, Miller N, Kelly R, et al. Systemic miRNA-195 differentiates breast cancer from other malignancies and is a potential biomarker for detecting noninvasive and early stage disease[J]. Oncologist, 2010, 15(7): 673-682.

[20]Vickers KC, Remaley AT. Lipid-based carriers of microRNAsand intercellular communication[J]. Curr Opin Lipidol, 2012, 23(2): 91-97.

[21]Zhao H, Shen J, Medico L, et al. A pilot study of circulating miRNAs as potential biomarkers of early stage breast cancer[J]. PLoS One, 2010, 5(10): e13735.

[22]Chin LJ, Slack FJ. A truth serum for cancer-microRNAs have major potential as cancer biomarkers[J]. Cell Res, 2008, 18(10): 983-984.

[23]Chen X, Ba Y, Ma L, et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J]. Cell Res, 2008, 18(10): 997-1006.

（本文編輯：胡苗苗）

Expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer and its clinical significance

XU Jiangang1,

LIN Feng, ZHANG Xianbo, HU Zhi, WANG Zhaojun, ZHAO Ting, SHEN Jie.1.Department of Oncological Surgery , Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of General Surgery, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou, 318020; 3.Department of Gynecologic Oncology, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000

Objective: To explore the expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer in preoperative and postoperative and two weeks and it correlation with clinicopathologic features of breast cancer.Methods:By normalized to miR-16, the expressions of miR-195 in 48 invasive ductal carcinoma of the breast cancer at preoperative and postoperative 2 weeks and 35 healthy controls were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-195 expression and clinicopathological characteristics were further analyzed.Results:Expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer was obviously higher than that in the healthy controls (P<0.05). At 2 weeks postopratively, a significant decrease of plasma miR-195 was observed, reaching levels of the healthy control subjects. ROC curve showed plasma levels of miR-195 could detect individuals with breast cancer with 94.4% sensitivity and 68.8% specificity. Correlative analysis of clinical features showed that there was no significant association between plasma miR-195 expression and the size of tumor, the state of ER, PR, lymph node metastasis and Her-2 receptor of breast cancer.Conclusion:Aberrant expression of miR-195 in plasma of breast cancer patients has potential use as novel noninvasive biomarkers for breast cancer. Key words:microRNA; miR-195; breast tumor

R730

A

1000-2138（2014）02-0105-05213112

2013-09-15

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20110119）。

許踐剛（1973-），男，浙江泰順人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

沈潔，主任醫(yī)師，Email：Linfeng0316@aliyun. com。