許踐剛，林峰，張憲波，胡芝，王昭君，趙挺，沈潔

（1.溫州市中心醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.臺州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺州 318020；3.溫州市中心醫(yī)院 婦瘤科，浙江 溫州 325000）

·論 著·

miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義

許踐剛1，林峰2，張憲波1，胡芝3，王昭君1，趙挺1，沈潔2

（1.溫州市中心醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.臺州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺州 318020；3.溫州市中心醫(yī)院 婦瘤科，浙江 溫州 325000）

目的：探討miR-195在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周血漿中的表達(dá)及其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法：以miR-16為內(nèi)參，采用莖環(huán)RT-qPCR方法檢測48例術(shù)前、術(shù)后2周乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及35例健康對照者血漿中miR-195的表達(dá)，并分析其表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果：乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血漿中miR-195的表達(dá)較健康對照者明顯升高（P＜0.05），術(shù)后2周表達(dá)明顯降低至健康對照者水平。ROC曲線顯示，血漿miR-195評價乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的敏感性和特異性可達(dá)94.4%和68.8%。與臨床特征相關(guān)性分析統(tǒng)計未見血漿miR-195表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫塊大小、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等臨床病理特征有明顯相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論：血漿中miR-195的異常表達(dá)可作為乳腺癌診斷的新的腫瘤標(biāo)志物。

微RNAs；miR-195；乳腺腫瘤

近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性微RNA，即microRNA（miRNA），長度只有22 nt左右，不編碼任何蛋白質(zhì)，但能夠高效調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達(dá)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。除外細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在血清、眼淚、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、羊水等體液均可檢測到miRNA[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞外miRNA可通過exosome轉(zhuǎn)運至受體細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)[2-5]，因此被認(rèn)為是非常理想的腫瘤早期診斷和篩查、治療效果判斷、預(yù)后評價的手段。最近有報道稱miR-195的失調(diào)表達(dá)不但與腎上腺皮質(zhì)腫瘤[6]、結(jié)腸癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]等相關(guān)，而且與乳腺癌[10-11]相關(guān)。但血漿miR-195表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系鮮有研究。為此，本研究通過莖環(huán)RT-qPCR方法比較乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及健康對照者血漿標(biāo)本中miR-195的表達(dá)，并分析其術(shù)后2周時表達(dá)的變化及其與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料48例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌術(shù)前及術(shù)后2周血漿標(biāo)本采自2011年1月至2012年11月間溫州市中心醫(yī)院腫瘤外科及臺州市第一人民醫(yī)院普外科住院患者。所有患者均為女性，年齡31～78歲，平均（52.2±11.5）歲。所有患者均經(jīng)病理確診，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織病理的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO乳腺腫瘤的病理學(xué)分類。雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）的免疫組化判斷參照美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）與美國病理家學(xué)會（CAP）的檢測指南。

1.2 材料Tri-Reagent BD試劑購自Sigma公司；ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Mastermix等試劑購自Toyobo公司；DEPC水購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血漿收集：取枸櫞酸鈉抗凝的外周靜脈血5 mL，3 000 r/min、離心10 min，取血漿，進(jìn)一步12 000 r/min、離心10 min后，將血漿置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時收集同時期年齡匹配的、無腫瘤病史的健康對照者35例，同樣方法收集血漿備用。

1.3.2 血漿RNA提?。喝⊙獫{標(biāo)本200 μL，加入1 μL 5 mg/mL糖原、20 μL 5 mol/L的冰醋酸及750μL的TRI Regent BD，充分混勻，按試劑說明書步驟抽提RNA。RNA沉淀經(jīng)80%乙醇洗滌后，加入DEPC處理水20μL，-80 ℃保存。

1.3.3 miR-195表達(dá)檢測：根據(jù)Wu等[9]報道的miRNA檢測的莖環(huán)RT-qPCR方法，以miR-16作為內(nèi)參，分析miR-195表達(dá)。相關(guān)分析的引物序列如表1所示。取5μL提取的RNA分別以miR-195及miR-16莖環(huán)RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存。以15μL反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time定量PCR。miRNA檢測反應(yīng)體系包括：1 μL RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特異前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。Realtime定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。Real-time定量PCR技術(shù)使用Applied Biosystems 7500儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以miR-16作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示標(biāo)本中miR-195相對表達(dá)量，其中△Ct=CtmiR-195-CtmiR-16。以N=2-△△Ct表示手術(shù)后2周血漿miR-195表達(dá)相對于術(shù)前血漿標(biāo)本的變化倍數(shù)，其中△△Ct=（CtmiR-195-CtmiR-16）術(shù)后-（CtmiR-195-CtmiR-16）術(shù)前。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。miR-195表達(dá)數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。配對樣本間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，兩組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗，ROC曲線分析敏感性和特異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿miR-16及miR-195檢測特異性分析如圖1顯示，miR-16及miR-195的RT-PCR產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，說明莖環(huán)RT-qPCR可以特異檢測miR-16及miR-195。

2.2 miR-195在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中的表達(dá)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中miR-195表達(dá)結(jié)果如圖2所示，提示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前血漿miR-195表達(dá)明顯高于健康對照者（P＜0.001），術(shù)后2周明顯降低（P＜0.001）。術(shù)后2周與健康對照者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其相對表達(dá)值分別為：5.12、2.20及2.66。

圖1 miR-195及miR-16莖環(huán)RT-qPCR熔解曲線

圖2 乳腺癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中miR-195表達(dá)水平

2.3 血漿miR-195作為乳腺癌患者篩選指標(biāo)的評價

基于上述結(jié)果，我們進(jìn)一步采用ROC曲線分析血漿miR-195表達(dá)篩選乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的特異性和敏感性。如圖3所示，比較乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者及健康對照者血漿miR-195表達(dá)的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.884（95% CI=0.815～0.952，P＜0.001），提示血漿miR-195可作為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的篩選指標(biāo)。以血漿miR-195相對表達(dá)量4.26作為評價臨界值判斷乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的敏感性和特異性分別為94.4%和68.8%。

圖3 ROC曲線分析乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血漿miR-195的表達(dá)

2.4 血漿miR-195表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析血漿中表達(dá)上調(diào)的miR-195的相對表達(dá)量和腫瘤大小，ER、PR、Her-2狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，血漿miR-195的表達(dá)水平與這些臨床病理特征無明顯相關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2 血漿miR-195表達(dá)和乳腺癌臨床病理因素的相關(guān)性分析

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展也是一個多基因改變的過程，同樣接受miRNA的調(diào)控作用。而腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤組織和細(xì)胞產(chǎn)生的與腫瘤形成、發(fā)生相關(guān)的物質(zhì)，一種良好的腫瘤標(biāo)志物對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，判斷療效及預(yù)后等方面均有重要的意義。來自血液中的腫瘤標(biāo)志物因其無創(chuàng)、高效尤其適用于臨床。近年來已發(fā)現(xiàn)許多與來自于腫瘤細(xì)胞本身的與乳腺癌TMN分期、血管侵犯、增殖指數(shù)、ER和/或PR狀態(tài)等預(yù)后因子相關(guān)的miRNA[12-13]，最近還發(fā)現(xiàn)miRNA可穩(wěn)定存在于血清和血漿中[1]。為此，使用循環(huán)miRNA作為潛在的早期腫瘤篩選標(biāo)記引起了人們的極大的興趣。最近的一些病例對照研究[14-17]發(fā)現(xiàn)了一些乳腺癌血液特征的miRNA。

miR-195屬于miR-15家族成員，基因位于17p13.1區(qū)域，與miR-497成簇分布。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織miR-195表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤關(guān)系密切。最近基于全血miRNA研究證明，乳腺癌患者全血系統(tǒng)的miR-195表達(dá)明顯高于健康對照者[18]，而且與前列腺癌、腎癌、結(jié)腸癌等比較，全血系統(tǒng)miR-195是乳腺癌具有相對特征性的miRNA[19]。但血漿miR-195的表達(dá)與乳腺癌臨床特征關(guān)系少有研究報道。

為分析miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義，本研究以miR-16為內(nèi)參，應(yīng)用莖環(huán)RT-qPCR技術(shù)檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前、術(shù)后2周及健康對照者血漿中miR-195表達(dá)。與全血檢測結(jié)果類似，本研究乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血漿miR-195表達(dá)明顯高于健康對照者。而且我們還發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)后2周血漿miR-195降低到健康對照者的水平。ROC曲線顯示血漿中miR-195的異常表達(dá)有較好的乳腺癌診斷價值，其敏感性和特異性可達(dá)94.4%和68.8%。但與臨床病理特征相關(guān)性分析統(tǒng)計未見血漿miR-195表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫瘤大小、ER、PR、Her-2狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等乳腺癌的臨床病理因素有明顯相關(guān)。

研究已證實，游離的miRNA容易被RNA酶降解，血漿中的miRNA主要通過外分泌泡（exosome）、Ago2蛋白、高密度脂蛋白等不同載體運輸[20]，但循環(huán)miRNA的起源迄今尚未完全闡明，曾經(jīng)被認(rèn)為來源于循環(huán)腫瘤細(xì)胞[21]、血液中血細(xì)胞[22]或疾病部位組織細(xì)胞[23]等。研究已經(jīng)表明miR-195在乳腺癌組織中低表達(dá)[10]，而全血[18]及本研究的血漿中miR-195的檢測結(jié)果是明顯上調(diào)，提示乳腺癌患者血漿miR-195可能不是起源于腫瘤組織，其來源有待于進(jìn)一步研究確定，但這并不影響其作為一種乳腺浸潤性導(dǎo)管癌血液學(xué)腫瘤標(biāo)志物的良好潛質(zhì)。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer and its clinical significance

XU Jiangang1,

LIN Feng, ZHANG Xianbo, HU Zhi, WANG Zhaojun, ZHAO Ting, SHEN Jie.1.Department of Oncological Surgery , Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of General Surgery, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou, 318020; 3.Department of Gynecologic Oncology, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000

Objective: To explore the expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer in preoperative and postoperative and two weeks and it correlation with clinicopathologic features of breast cancer.Methods:By normalized to miR-16, the expressions of miR-195 in 48 invasive ductal carcinoma of the breast cancer at preoperative and postoperative 2 weeks and 35 healthy controls were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-195 expression and clinicopathological characteristics were further analyzed.Results:Expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer was obviously higher than that in the healthy controls (P<0.05). At 2 weeks postopratively, a significant decrease of plasma miR-195 was observed, reaching levels of the healthy control subjects. ROC curve showed plasma levels of miR-195 could detect individuals with breast cancer with 94.4% sensitivity and 68.8% specificity. Correlative analysis of clinical features showed that there was no significant association between plasma miR-195 expression and the size of tumor, the state of ER, PR, lymph node metastasis and Her-2 receptor of breast cancer.Conclusion:Aberrant expression of miR-195 in plasma of breast cancer patients has potential use as novel noninvasive biomarkers for breast cancer. Key words:microRNA; miR-195; breast tumor

R730

A

1000-2138（2014）02-0105-05213112

2013-09-15

溫州市科技計劃項目（Y20110119）。

許踐剛（1973-），男，浙江泰順人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

沈潔，主任醫(yī)師，Email：Linfeng0316@aliyun. com。