袁琦 張征 胡小宣

湖南省人民醫(yī)院肝病內(nèi)科，湖南長(zhǎng)沙 410005

姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

袁琦 張征 胡小宣

湖南省人民醫(yī)院肝病內(nèi)科，湖南長(zhǎng)沙 410005

目的研究姜黃素體外對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF表達(dá)的影響。方法不同濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)姜黃素處理2013年8月—2014年2月中南大學(xué)提供的人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo24 h后，用Real-time PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF mRNA表達(dá)的變化，用Western blot法檢測(cè)姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞經(jīng)過(guò)姜黃素處理24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L姜黃素組VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素能下調(diào)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF的表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)，這可能是姜黃素抑制結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖及侵襲性的機(jī)制之一。

姜黃素；結(jié)腸癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用，且毒性低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力，尤其是其抗腫瘤作用受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，雖然近年來(lái)以手術(shù)、化療、放療、免疫等的綜合治療手段取得了一定的進(jìn)展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制著化療藥物和免疫制劑等的應(yīng)用和療效。有研究表明，姜黃素能顯著抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]，姜黃素能顯著抑制人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[2]，研究證實(shí)在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）起到了極其重要的作用[3]。該實(shí)驗(yàn)以2013年8月—2014年2月中南大學(xué)提供的結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀(guān)察了不同濃度姜黃素對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，以求從多角度對(duì)姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用進(jìn)行研究，對(duì)結(jié)腸癌臨床治療提供有益的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞由中南大學(xué)腫瘤研究所提供；姜黃素購(gòu)自Sigma公司，稱(chēng)取3.684 mg的原料藥充分溶解于1 mL DMSO中，得到終濃度為10 mmol/L的母液，臨用時(shí)用完全細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，引物由大連寶生物公司合成。蛋白提取液及ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司，兔抗人VEGF多克隆抗體及羊抗兔二抗lgG購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞接種于含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lovo細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組（姜黃素0 μmol/L，加入等量DMSO），姜黃素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L組，處理后再置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 Real-time PCR

采用Trizo1試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，計(jì)算OD260/280，比值在1.8～2.0的RNA標(biāo)本用于反轉(zhuǎn)錄?？俁NA按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于Real-time-PCR擴(kuò)增。VEGF引物：5'端: 5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端:5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，變性、退火溫度為94℃與72℃，40個(gè)循環(huán)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品CT值計(jì)算出樣品中所含的模板量。

1.4 Western Blot

用蛋白提取液提取細(xì)胞蛋白，BCA測(cè)總蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，上樣量為20 μg。5%脫脂奶粉TBS緩沖液封閉，4℃過(guò)夜，加兔抗人VEGF多克隆抗體(1：500)室溫2 h，洗膜30 min，加入羊抗兔二抗(1：1000)室溫結(jié)合 1 h，ECL顯色，內(nèi)參采用 β-actin。采用 Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。以VEGF條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度比值代表VEGF蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 不同劑量姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

利用Primer 3.0軟件分別設(shè)計(jì)出擴(kuò)增人VEGF和GAPDH mRNA的引物，Real-time PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)，見(jiàn)表1，并用EXCEL做出各組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量柱狀圖表達(dá)，見(jiàn)圖1，姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對(duì)照組相比，VEGF mRNA的表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性。

表1 姜黃素處理后，Lovo細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)（）

表1 姜黃素處理后，Lovo細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)（）

注：n=3，與對(duì)照組比較*P＜0.05。

組別VEGF mRNA表達(dá)（VEGF/GAPDH）VEGF蛋白表達(dá)（VEGF/β-actin）Control姜黃素5 μmol/L姜黃素10 μmol/L姜黃素20 μmol/L姜黃素40 μmol/L 0.422±0.015（0.253±0.016）*（0.198±0.009）*（0.166±0.011）*（0.116±0.009）* 0.0730±0.0042（0.0487±0.0030）*（0.0406±0.0048）*（0.0322±0.0057）*（0.0287±0.0025）*

2.2 不同劑量姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

不同劑量姜黃素處理Lovo細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，用Western Blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)（結(jié)果見(jiàn)圖2），并用Image-Pro Plus6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析（結(jié)果見(jiàn)表1，圖3），姜黃素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L組與對(duì)照組相比VEGF蛋白表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性。

圖1 檢測(cè)姜黃素處理Lovo細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)

圖2 檢測(cè)姜黃素處理Lovo細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)

圖3 檢測(cè)姜黃素處理Lovo細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)灰度比均值（n=3，P＜0.05）

3 討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF隨著腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移而表達(dá)明顯升高[4]。VEGF信號(hào)還與腫瘤細(xì)胞的淋巴管、淋巴結(jié)侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。梁?jiǎn)⒘妊芯堪l(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)水平與大腸癌組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。且臨床觀(guān)察發(fā)現(xiàn)大腸癌患者術(shù)前血清VEGF水平與大腸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。有研究者利用同源重組將結(jié)腸腸癌細(xì)胞系中VEGF-A敲除后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞缺失了VEGF信號(hào)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，且細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性增強(qiáng)[8]，而在臨床上僅僅通過(guò)阻斷細(xì)胞表面的VEGF受體來(lái)治療結(jié)直腸癌效果是有限的。

目前研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠?qū)ο的[瘤有很好的抑制作用，其藥理活性主要表現(xiàn)在能夠下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-k B）的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，姜黃素可有效抑制結(jié)腸腺癌細(xì)胞集落生長(zhǎng)和侵襲能力[10]。不同濃度姜黃素作用人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞24 h，增殖抑制顯著[11]。

該研究用4種不同濃度的姜黃素分別作用Lovo細(xì)胞24 h后，利用Real-time PCR及Western Blot方法檢測(cè)VEGF的mRNA及蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)各姜黃素組（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）與對(duì)照組比較，VEGF的mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且姜黃素的作用濃度越高，VEGF的表達(dá)量越低，該作用呈劑量依賴(lài)，提示姜黃素能通過(guò)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo中VEGF的表達(dá)來(lái)抗結(jié)腸癌血管形成，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此結(jié)果與賈佳等的觀(guān)點(diǎn)一致，他們發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中 β-catenin、VEGF的表達(dá)[12]。在多個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中，均有研究證實(shí)姜黃素能下調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步可利用建立的結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，從體內(nèi)水平研究姜黃素能否下調(diào)瘤組織VEGF的表達(dá)，且姜黃素是否通過(guò)NF-KB信通路來(lái)下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，該機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。VEGF是抗癌藥物治療的新靶點(diǎn)，姜黃素作用后的人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞VEGF水平下降，提示姜黃素可能通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制了VEGF促進(jìn)腫瘤新生血管的作用，從而抑制了結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移。該研究為姜黃素的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

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Effects of Curcumin on the Expression of VEGF in Human Colon Cancer Lovo Cells

YUAN QiZHANG Zheng HU Xiapxuan
Department of Hepatology,Hunan Provincial People's Hospital,Changsha,Hunan Province,410005,China

Objective To study the effect of curcumin on the expression of VEGF in human colon cancer Lovo cells in vitro. Methods The human colon cancer cell lines Lovo were treated with 0 μmol/L,5 μmol/L10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L curcumin for 24 hours respectively,then we detected the human colon cancer cell lines VEGF mRNA expression by Real-time PCR and VEGF protein expression by Western Blot.Results After the human colon cancer cell lines Lovo cells treated with curcumin for 24 hours respectively,the expression of VEGF mRNA and protein of the curcumin-treated groups(5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L, 40 μmol/L)had more significant reduction compared with control group (P<0.05).Conclusion Curcumin could decrease the expression of VEGF in human colon cancer Lovo cells dose-dependently,this may provide some evidence for the mechanism that curcumin could inhibit the proliferation and invasion of colon cancer Lovo cells.

Curcumin;Colon cancer;Vascular endothelial growth factor

R587.1

A

1674-0742（2014）12（b）－0035-03

2014-09-16）（

2014-09-16）

袁琦（1983.1-），女，湖南邵東人，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤。