邱 萍，劉平平，孔德松，李 相，李寰舟，王娟紅，潘蘇華

（南京中醫(yī)藥大學1．中藥學一級學科，2．藥學院，江蘇南京 210023；3．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術學院，江蘇鹽城224005；4．南京市中醫(yī)院科教科，江蘇南京210001）

復方銀杏制劑對急性酒精性肝損傷小鼠的防護作用及其機制

邱 萍1，2，劉平平3，孔德松4，李 相1，2，李寰舟1，2，王娟紅1，2，潘蘇華1，2

（南京中醫(yī)藥大學1．中藥學一級學科，2．藥學院，江蘇南京 210023；3．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術學院，江蘇鹽城224005；4．南京市中醫(yī)院科教科，江蘇南京210001）

目的探討復方銀杏葉制劑（CGB）對急性酒精性肝損傷的保護作用及其機制。方法 雄性KM小鼠，按照分組分別ig給予CGB 0．125，0．25和0．75 g·kg－1、銀杏葉提取物（GBE）0．125 g·kg－1及聯(lián)苯雙酯（Bif）0．15 g·kg－1，連續(xù)8周，于第4和第8周末分別單次ig 56%白酒0．01和0．016 L·kg－1。測定血清谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、線粒體門冬氨酸氨基轉移酶（mGOT）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量，HE染色法觀察肝組織病理變化，W estern蛋白質印跡法檢測肝組織細胞色素P450（CYP）2E1、核因子相關因子2（Nrf2）和TNF-α表達。結果 與正常對照組相比，模型組小鼠血清GOT和m GOT活性顯著升高（P＜0．01）；與模型組相比，CGB 0．25和0．75及Bif 0．15 g·kg－1組GOT和mGOT活性顯著降低（P＜0．05，P＜0．01）；各組間血清GPT活性無顯著性差異。HE染色顯示，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組肝細胞脂肪空泡和炎癥細胞浸潤顯著改善，且效果優(yōu)于GBE。CGB可顯著增強模型小鼠肝組織Nrf2表達，量效關系均呈正相關（r＝0．942，P＜0．01）；并顯著降低肝組織CYP2E1和TNF-α表達，量效關系均呈負相關（r＝－0．987，P＜0．05；r＝－0．940，P＜0．05）；此外，CGB組血清TNF-α水平亦顯著下降（P＜0．05，P＜0．01）。結論 CGB減輕酒精導致急性肝氧化應激損傷，其機制可能與促進肝組織Nrf2表達、抑制CYP2E1和TNF-α表達并降低血清TNF-α水平有關。

復方銀杏葉制劑；肝損傷；氧化應激；細胞色素P450 2E1；核因子相關因子2；腫瘤壞死因子α

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．011

酒精性肝?。╝lcoho lic liver disease，ALD）發(fā)病機制十分復雜，氧化應激、腸源性內毒素血癥、免疫反應、遺傳因素和營養(yǎng)不良等多種因素均參與ALD的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有研究認為，乙醇代謝不僅產生大量還原型輔酶Ⅰ（reduced nicotinam ide adenine dinucleotide，NADH），增加了呼吸鏈中的電子流，還可激活微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)（m icrosomal ethano l oxidase system，MEOS）和還原型輔酶Ⅱ（nicotinam ide adenine dinuc leotide phosphate，NADPH）氧化酶，三者均可產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1］。其中，MEOS在乙醇代謝過程中的催化作用有賴于細胞色素P450 2E1（cytochrom e P450 2E1，CYP2E1）參與，可使肝內氧化應激產物增多，抗氧化物減少，引起肝內ATP和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭［2］。氧化應激還可進一步導致脂質過氧化，且產物如丙二醛（m alondia ldehyde，MDA）可刺激機體產生抗體引起相應免疫應答，誘導炎性細胞因子表達，加重酒精性肝損傷［3］。與此同時，人體代謝乙醇時還會啟動一些抗氧化通路來拮抗氧化應激損傷。其中，核因子相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是肝防御氧化應激的重要調節(jié)因子，可介導體內抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達，降低乙醇導致的肝毒性［4］。

迄今為止，尚無治療藥物可根治ALD，研發(fā)安全有效干預ALD病程的藥物具有重大意義。研究認為，氧化應激和炎癥反應是ALD發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，而抗氧化及抗炎作用的藥物有望成為臨床治療ALD的潛在藥物。大量研究表明，銀杏葉中銀杏黃酮母核中含有還原性羥基功能基團，可直接清除氧自由基、羥自由基和過氧化氫等，抑制脂質過氧化反應及炎癥因子表達；還可提高抗氧化物GSH水平及氧化型GSH還原酶活性［5－6］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extracts，GBE）不僅顯著減輕乙醇引起的體內脂質代謝紊亂，改善血漿脂質過氧化反應，還可一定程度抑制長期飲酒所致的肝纖維化。刺梨最早記載于《本草綱目拾遺》，具有健脾消食和滋陰潤燥作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，刺梨富含維生素C、維生素E、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和刺梨黃酮等。本研究將兩者配伍成復方銀杏葉制劑（compound Ginkgo biloba，CGB），觀察其是否可產生協(xié)同抗氧化作用，從而減輕乙醇導致的肝氧化應激損傷。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、試劑和儀器

清潔級昆明種健康雄性小鼠，體質量18～22 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK（滬）2007-0005，常規(guī)條件飼養(yǎng)。GBE，邳州鑫源生物制品有限公司提供，其中黃酮苷≥24．0%，銀杏內酯≥6．0%；刺梨汁粉，江蘇天江藥業(yè)股份有限公司，維生素C含量≥16 g·L－1；CGB，本室制備，配方已申請專利（專利號：01108284．4），由銀杏葉提取物26%、刺梨汁粉26%和藥用輔料48%組成，按此比例混合加水配制成不同濃度藥物，本實驗室采用HPLC法測定總黃酮苷含量≥4．8%，銀杏內酯≥1．2%；聯(lián)苯雙酯（bifendate，Bif），批號：08040103，北京協(xié)和制藥廠；酒精度56%（V／V）紅星二鍋頭白酒，北京紅星股份公司。血清谷丙轉氨酶（a lanine am inotransferase，GPT）、谷草轉氨酶（aspartate am inotransferase，GOT）和線粒體門冬氨酸氨基轉移酶（m itochond ria l aspartate am inotransferase，m GOT）測定試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司；小鼠血清腫瘤壞死因子α（tum or necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；30%丙烯酰胺溶液，美國BioRad公司；BCA蛋白質定量檢測試劑盒，美國Pierce公司；磷酸酶抑制劑，上海生工生物工程有限公司；兔抗小鼠CYP2E1、Nrf2、TNF-α和β肌動蛋白單抗及辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG抗體，南京Bioworld公司；抗管蛋白抗體，美國Affinity公司；化學發(fā)光液，美國Millipore公司；超純水由M illipore超純水系統(tǒng)制備；其他試劑均為國產分析純。酶標儀，美國Bio-TEK公司；VITROS 950全自動生化分析儀，美國強生公司；DMLS2光學顯微鏡，德國LEICA公司；AnkeTDL-40B離心機，上海安壽科學儀器廠；Mettler Toledo AL-104電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CXHF-D高速內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng)垂直電泳，蛋白轉印裝置，凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；MSD97K49微量離心機，高速冷凍離心機，Beckm an公司；AF10制冰機，美國SCORTSMAN公司；移液器，德國Eppendorf公司；－80℃冰箱，美國Thermo公司。

1．2 動物分組、處理和樣本制備

健康雄性KM小鼠82只，隨機分為正常對照組、模型對照組、CGB 0．125，0．25和0．75 g·kg－1組、GBE 0．125 g·kg－1組及Bif 0．15 g·kg－1組，正常對照組10只，其余組12只。模型對照組和正常對照組ig給予同體積蒸餾水，其余組ig不同劑量藥物，每次1次，連續(xù)8周。第4周末除正常對照組外余組單次ig白酒0．01 L·kg－1（4．48 g·kg－1），繼續(xù)觀察并記錄體質量變化。第8周末，除正常對照組給蒸餾水外，余組均ig白酒0．016 L·kg－1（6．72 g·kg－1），禁食12 h后眼眶取血，4℃，1200×g離心15 m in制備血清，脫臼處死小鼠，迅速取出肝組織，在左肝葉同一部位，取一小塊肝組織用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，以4%中性甲醛溶液固定，剩余組織－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 組織病理學觀察

上述肝組織經4%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5μm，常規(guī)HE染色后于光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變，根據(jù)病變程度進行評估積分（表1）并做統(tǒng)計學分析。

Tab．1 Deg ree standard o f hepatocyte fatty degeneration analysis

1．4 血清GPT，GOT和mGOT活性測定

運用全自動生化分析儀測定血清中GPT，GOT和mGOT活性。

1．5 血清TNF-α測定

采用雙抗體夾心ELISA法，嚴格按照試劑盒說明操作，于全波長酶標儀450 nm讀取吸光度值，測定血清中TNF-α含量。

1．6 Western蛋白質印跡法檢測肝組織CYP2E1，Nrf2和TNF-α表達

稱取肝組織0．05 g，按質量／體積比1∶5加入預冷RIPA裂解液，立即加入PMSF和磷酸酶抑制劑，冰上孵育30 m in，移入離心管4℃，20 000×g離心15 m in取上清液為細胞裂解液，吸取部分上清液，BCA法測定蛋白質濃度。其余加等體積的6×電泳加樣緩沖液，沸水浴10 m in。實驗前1500×g離心10 m in，配制SDS-PAGE凝膠進行上樣（上樣量50μg），電泳40 m A 1．5 h，轉膜100 V 1．5 h。脫脂奶粉封閉，一抗及二抗孵育，將PVDF膜放入Bio-Rad Chem iDoc XRS＋化學發(fā)光成像系統(tǒng)，化學發(fā)光劑ECL顯色，用凝膠成像系統(tǒng)圖像分析軟件分析各條帶積分吸光度，待測蛋白相對表達水平用待測蛋白管蛋白條帶與β肌動蛋白條帶積分吸光度比值表示。

1．7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2．1 CGB對小鼠一般情況的影響

正常對照組小鼠實驗期間皮毛光滑，活動正常。模型組和各給藥組灌胃白酒后，約2 m in后見四肢癱軟、行走不穩(wěn)或酣睡等醉酒狀態(tài)；灌胃后6 h內小鼠皮毛蓬亂，精神萎靡，行動遲緩。各給藥組小鼠毛發(fā)光澤度較好，醒酒后活動有不同程度增加。

2．2 CGB對肝損傷小鼠體質量變化的影響

由表2所見，各組小鼠給藥前體質量無顯著性差異；第4周末ig白酒0．01 L·kg－1后，小鼠體質量增長有減緩趨勢；至第8周，模型組小鼠較正常對照組體質量明顯降低（P＜0．01），CGB各劑量組、GBE組和Bif組小鼠體質量均明顯增加（P＜0．05，P＜0．01）。

Tab．2 Effec t o f com pound Ginkgo biloba（CGB）on body m ass o fm ice w ith alcoho l-induced liver in ju ry

2．3 CGB對肝損傷小鼠GPT，GOT和m GOT活性的影響

由表3可見，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清GPT，GOT和mGOT活性顯著性升高（P＜0．01），CGB各劑量組和Bif組GPT活性無明顯變化；CGB 0．25和0．75 g·kg－1組及Bif 0．15 g·kg－1組GOT和mGOT活性顯著降低（P＜0．05），GBE 0．125 g·kg－1對GPT，GOT和mGOT活性無明顯影響。

Tab．3 Effect o f CGB on activity o f alanine am ino trans ferase（GPT），aspartate am ino trans ferase，（GOT）and m itochond rial aspartate am ino trans ferase（mGOT）o fm ice w ith alcoho l-induced liver in jury

2．4 CGB對肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

由圖1和表4所見，正常對照組肝細胞索排列較整齊，未見水樣變性及脂肪變性，未見纖維結締組織增生及假小葉形成，Kup ffer細胞未見增生，毛細血管及匯管區(qū)內膽管未見膽汁淤積，匯管區(qū)未見纖維組織增生及炎性細胞浸潤（圖1A）。模型組肝組織均可見肝細胞水樣變性，肝細胞脂肪變性，匯管區(qū)炎細胞浸潤（圖1B），與正常對照組相比，有顯著性差異（P＜0．01）。與模型組比較，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組和Bif 0．15 g·kg－1組（圖1G）肝損傷顯著性減輕（P＜0．01，P＜0．05），少量細胞存在炎癥細胞浸潤及肝脂肪變較輕（圖1D和E）。GBE組肝細胞部分細胞可見片狀水腫和脂肪變，匯管區(qū)炎細胞浸潤（圖1F），但無顯著性差異，提示CGB效果優(yōu)于單方。

2．5 CGB對肝損傷小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達的影響

由圖2結果表明，與正常對照組比較，模型組肝組織CYP2E1表達升高（P＜0．01）；與模型組比較，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組肝組織CYP2E1表達降低，其量效關系呈負相關（r＝－0．987，P＜0．05）；Bif0．15 g·kg－1組CYP2E1表達水平亦顯著性降低（P＜0．05），GBE組無明顯變化。

Fig．1 Effect o f CGB on livermorpho logical changes o fm ice w ith alcoho l-induced liver in jury（HE staining）．See Tab．2 for the m ouse treatm ent．A：norm al control group；B：m odel group；C，D and E：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively；F：GBE 0．125 g·kg－1group；G：bifendate 0．15 g·kg－1group．The black arrow indicates the fat droplets in the liver sections．The red arrow indicates neutrophil infiltration．

Tab．4 Effec t o f com pound Ginkgo biloba（CGB）on deg ree o f s teatosis o f m ice w ith alcoho l-induced liver in jury

Fig．2 Effect o f CGB on cytoch rome P450（CYP）2E1 p ro tein exp ression in liver tissue o f m ice w ith alcho linduced liver in ju ry by Western b lotting．See Tab．2 for the mouse treatment．1：normal control group；2：model group；3：bifendate 0．15 g·kg－1group；4：GBE 0．125 g·kg－1group；5－7：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively．B was the sem iquantitative result of A．IA：integrated absorbance．，n＝3．**P＜0．01，compared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with modelgroup．

2．6 CGB對肝損傷小鼠肝組織Nrf2和TNF-α蛋白表達的影響

Fig．3 Effec t o f CGB on NF-E2-related fac to r 2（Nrf2）and tum o r nec rosis fac to r-α（TNF-α）p ro tein exp ression in liver tissue o f m ice w ith alcoho l-induced liver in jury by Wes tern b lotting．See Tab．2 for the mouse treatment．1：normal control group；2：model group；3：bifendate 0．15 g·kg－1group；4：GBE 0．125 g·kg－1group；5－7：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively．B and C were the sem iquantitative results of A．，n＝3．**P＜0．01，compared w ith normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with modelgroup．

圖3結果表明，與正常對照組比較，模型組Nrf2表達無明顯變化，TNF-α表達水平明顯升高（P＜0．01）；與模型組比較，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組Nrf2表達水平明顯增高，其量效關系呈正相關（r＝0．942，P＜0．05）；TNF-α表達水平明顯降低（P＜0．05，P＜0．01），其量效關系呈負相關（r＝－0．940，P＜0．05）；Bif 0．15 g·kg－1組Nrf2表達水平明顯增高（P＜0．05），TNF-α表達水平明顯降低（P＜0．05）；GBE組Nrf2和TNF-α無明顯變化。

2．7 CGB對肝損傷小鼠血清TNF-α水平的影響

圖4結果表明，與正常對照組比較，模型組血清TNF-α濃度顯著升高（P＜0．01）；CGB 0．25和0．75 g·kg－1和Bif0．15 g·kg－1可明顯降低模型小鼠血清TNF-α水平（P＜0．05，P＜0．01），GBE組無明顯變化。

Fig．4 Effect o f CGB on serum TNF-αlevel o f m ice w ith liver in jury induced by alcoho l．See Tab．2 for the mouse treatment．1：norm al control group；2：model group；3：bifendate 0．15 g·kg－1group；4：GBE 0．125 g·kg－1group；5－7：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively．，n＝8－12．**P＜0．01，com pared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with modelgroup．

3 討論

以往研究認為，乙醇通過多條途徑導致氧化應激并可導致炎癥級聯(lián)反應，誘發(fā)生物膜脂質過氧化損傷，促進白細胞游走及趨化作用；損傷肝細胞線粒體，減少ATP產生，干擾脂肪酸β氧化，減少ATP生成，并導致甘油三酯在肝沉積；亦可通過調控線粒體的凋亡信號分子Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶等表達，誘導細胞凋亡［7－8］。Eckert等［9］報道，GBE可減輕體內氧化應激損傷，刺梨中豐富的刺梨黃酮及多糖亦具有抗氧化應激和減輕酒精誘導的肝損傷作用［10］。本研究結果顯示，實驗第4周末單次ig白酒（56%V／V，0．01 L·kg－1）導致模型對照組小鼠不能耐受酒精刺激，表現(xiàn)為后期體質量嚴重下降，而CGB各組和Bif組小鼠耐受性較好，體質量仍持續(xù)上升。本研究采用酒精急性肝損傷模型，一次大劑量酒精沖擊（56%V／V，0．016 L·kg－1）和禁食聯(lián)合造模，其機制除與乙醇早期干擾肝脂質代謝外，還與禁食引起肝脂肪動員有關，禁食引起糖原含量降低，加速脂肪被轉運到肝細胞進行糖異生合成脂肪［11］。本研究結果可見，與模型組比較，CGB各組GPT活性無明顯變化，可能與小鼠肝具有較強的自主修復和代償能力有關［12］。CGB 0．25和0．75 g·kg－1組與模型組比較，血清GOT和m GOT活性降低，提示CGB可保護乙醇引起的細胞膜以及線粒體膜損傷。GOT有2種同工酶，一種存在細胞漿中，為上清液GOT；另一種存在線粒體內，為線粒體GOT。正常血清GOT主要為上清液GOT，當肝細胞內線粒體受到嚴重損傷時可導致線粒體GOT升高，該指標有助于判斷肝損傷的程度及預后。除此之外，急性酒精中毒后禁食時間越長，實驗組肝脂肪變性程度與對照組差異越大，可能與禁食引起肝脂肪動員程度有關［12］。本研究中CGB各組不同程度脂肪變減輕，炎癥細胞浸潤和細胞壞死情況也相應減少。

以往研究報道，CYP2E1與體內乙醇代謝密切相關，肝中大部分CYP2E1位于內質網，超微結構觀察發(fā)現(xiàn)長期飲酒后滑面內質網出現(xiàn)增生；且CYP2E1在中央靜脈周圍肝細胞內呈高表達，這與該處氧化應激最活躍及組織供氧不足相一致，為酒精性肝損傷易發(fā)部位。Lu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，敲除CYP2E1基因可有效抑制乙醇所致的脂肪肝、酒精性肝炎和肝纖維化。前期研究成果顯示，CGB可通過提高肝組織GSH和SOD水平，降低MDA水平防治大鼠慢性酒精性肝損傷，并采用“Cocktail”探針法結合高效液相色譜研究發(fā)現(xiàn)，其作用可能與CGB抑制乙醇誘導的CYP2E1酶水平升高而降低氧化應激損傷有關［14］。本研究采用Western蛋白質印跡法進一步研究證實，CGB能夠抑制乙醇刺激后肝組織CYP2E1高表達，拮抗乙醇代謝過程的氧化應激及脂質過氧化反應。

Nrf2是體內抗氧化關鍵的核轉錄因子，可通過抗氧化應激維護肝功能穩(wěn)定，對降低乙醇介導的肝毒性及炎癥反應均起著重要作用。Nrf2與Keap l解偶聯(lián)后轉移入核，與抗氧化反應元件結合，通過轉錄性調節(jié)編碼脫毒酶和抗氧化蛋白的基因而達到細胞保護作用［15］。本研究結果表明，模型對照組Nrf2表達高于正常對照組，提示乙醇引起肝細胞氧化應激損傷，進而誘導Nrf2表達，可能作為肝細胞對氧化應激一種適應性保護反應，這與Gong等［16］研究結果一致。與模型對照組相比，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組Nrf2表達呈顯著性升高，效果優(yōu)于單方，提示CGB預處理可誘導飲酒小鼠Nrf2表達，通過產生下游相關抗氧化物酶來起到減輕急性酒精誘導肝氧化應激的作用，可能為銀杏制劑抗氧化保護肝細胞的具體機制之一。

TNF-α是酒精性肝損傷引發(fā)氧化應激和炎癥級聯(lián)反應的關鍵細胞因子。TNF-α是一非糖基化蛋白，可直接引起肝細胞脂肪變性、炎癥及肝細胞壞死；促進機體外周脂肪分解，使游離脂肪酸通過血液進入肝臟并蓄積；還可減少對離脂肪酸和低密度脂蛋白等消除［17］。Ji等［18］報道，TNF-α主要通過與肝細胞的TNF-R1結合而導致肝損傷，將TNF-R1基因敲除可阻斷乙醇所致的脂肪肝。此外，TNF-α會通過促進固醇調節(jié)元件結合蛋白和抑制脂聯(lián)素（adiponectin）基因表達而導致脂肪合成的增加［19］。TNF-α還可加重線粒體功能障礙，造成線粒體內ROS增多和抗氧化物水平進一步下降，最終誘導肝細胞發(fā)生細胞凋亡。因此，抑制肝內TNF-α表達可有望減輕TNF-α水平可減輕酒精性肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，CGB抑制乙醇引起的TNF-α高表達，進而避免肝細胞線粒體功能受損，抑制細胞凋亡，同時改善肝細胞脂肪變性和炎癥細胞浸潤。

綜上所述，CGB對酒精性急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與誘導肝組織Nrf2表達，同時減少乙醇引發(fā)肝組織CYP2E1和TNF-α高表達和降低血清TNF-α水平有關。

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Protec tive effec t o f Com pound Ginkgo against acu te alcoho l-induced liver in ju ry and its m echanism

QIU Ping1，2，LIU Ping-ping3，KONG De-song4，LIXiang1，2，LIHuan-zhou1，2，WANG Juan-hong1，2，PAN Su-hua1，2
（1．Nationa l First-Class Key Discip line for Traditiona l Chinese Medicine，2．Co llege o f Pharm acy，Nan jing University o f Chinese Medicine，Nan jing 210023，China；3．Yancheng Institute o f Health Science，Yancheng 224005，China；4．Nan jing Municipa l Hospital o f TCM，Nan jing 210001，China）

OBJECTlVETo observe the protective effect and mechanism of Compound Ginkgo biloba（CGB）against alcohol-induced liver injury．METHODSMice were given CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1，Ginkgo biloba extract（GBE）0．125 g·kg－1and bifendate（Bif）0．15 g·kg－1for8 weeks，respectively．At the end of 4th week the m ice were given wine by gavage（56%V／V，0．01 L·kg－1），and（56%V／V，0．016 L·kg－1）at the end of the 8 th week．The serum was obtained to m easure a lanine transam inase（GPT），aspartate am inotransam inase（GOT），m itochond rial aspartate am inotransferase（mGOT）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）．Liver histopathology was revealed by HE staining．The p rotein exp ression o f cytochrom e P450（CYP）2E1，NF-E2-re lated factor 2（Nrf2）and TNF-αin the liver was analyzed by Western blotting．RESULTSCompared with normalcontrolgroup，the activities of GOT and m GOT were increased in mode l group（P＜0．01）．Com pared w ith m ode l group，CGB 0．25 and 0．75 g·kg－1groups and Bif 0．15 g·kg－1group significantly decreased the activity of GOT and m GOT in serum（P＜0．05，P＜0．01），while there was no significant difference between these groups in serum GPT activity（P＞0．05）．Fatty degeneration and neutrophil infiltration were significantly ameliorated in CGB 0．25 and 0．75 g·kg－1groups．Pre lim inary mechanism research showed CGB not on ly increased the protein expression of Nrf2 w ith a positive dose-effect relationship（r＝0．942，P＜0．01），but reduced the protein exp ression o f hepatic CYP2E1 and the leve l o f TNF-αin hepatic tissue w ith a negative dose-effect relationship（r＝－0．987，P＜0．05；r＝－0．940，P＜0．05）．In addition．The level of TNF-αwas also significantly decreased in the serum（P＜0．05，P＜0．01）．CONCLUSlONCGB may protect the liver from acute alcoholic injury and the mechanism may be that it increases the protein expression of Nrf2，restrains the protein expression of hepatic CYP2E1 and TNF-αand reduces the TNF-αlevel in the serum．

Ginkgo biloba；liver injury；oxidative stress；cytochrome P450 2E1；NF-E2-related factor 2；tumor necrosis factor-α

PAN Su-hua，E-mail：2641033550＠qq．com，Tel：（025）85811207

R285，R963

1000-3002（2014）03-0373-07

Foundation item：The project supported by Priority Academ ic Program Deve lopment o f Jiangsu Higher Educa tion Institutions（ysxk-2010）

2013-11-28 接受日期：2014-05-26）

（本文編輯：齊春會）

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（ysxk-2010）

邱 萍（1989－），女，碩士研究生，主要從事天然藥物預防和治療酒精性肝病研究；潘蘇華（1956－），女，教授，碩士生導師，主要從事天然藥物預防和治療酒精性肝病研究。

潘蘇華，Tel：（025）85811207，E-mail：2641033550＠qq．com