歐喜超 夏輝 李強 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 章建康 池俊英 趙雁林

結(jié)核病的早期診斷，對于很好地控制結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義。固體培養(yǎng)具有很高的診斷價值，但耗時較長，至少需要6～8周的時間。近年來涌現(xiàn)出很多新的技術(shù)和方法用于結(jié)核分枝桿菌的快速診斷及鑒定[1-2]。然而除了檢測效能，檢測成本也是制約各種技術(shù)或方法能否推廣的決定性因素之一。結(jié)核分枝桿菌快速DNA提取環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù)(procedure for ultra rapid extraction of loop-mediated isothermal amplification, PURE-LAMP；Eiken Chemical，日本)是一種基于分子生物學(xué)原理的快速檢測試劑盒，整個試劑盒采用封閉的反應(yīng)體系，在反應(yīng)體系內(nèi)加入2條內(nèi)引物和2條外引物，67 ℃等溫擴增40 min，然后通過紫外線照射觀察熒光強度進行結(jié)果判斷[3]。國內(nèi)外的相關(guān)研究表明，PURE-LAMP檢測操作簡單、檢測準確性高，非常適合在實驗室條件不足或技術(shù)力量薄弱的結(jié)核病高負擔(dān)地區(qū)應(yīng)用[4]。目前尚缺乏關(guān)于PURE-LAMP檢測成本的相關(guān)報道，本研究通過對比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法和PURE-LAMP檢測的成本，從成本角度出發(fā)，評估PURE-LAMP檢測在我國縣(區(qū))級實驗室應(yīng)用的可行性。

材料和方法

一、研究資料的來源

選取項目指定的河南省新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治(簡稱“結(jié)防”)所、獲嘉縣CDC以及河南省CDC作為研究現(xiàn)場。2011年3月至2012年2月，新鄉(xiāng)市結(jié)防所和獲嘉縣CDC共連續(xù)納入1378例臨床初診肺結(jié)核可疑患者，新鄉(xiāng)市923例，獲嘉縣455例。實驗室對每份納入患者痰標本同時進行固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測，培養(yǎng)陽性的菌株4 ℃冰箱保存，每月送至河南省CDC完成對硝基苯甲酸(PNB)菌群鑒定。為保證鑒定結(jié)果的準確性，每批固體培養(yǎng)陽性菌株在鑒定前需要進行傳代復(fù)蘇。

二、研究方法

每例納入患者留取3份痰標本(即時痰、夜間痰和晨痰)，實驗室工作人員對晨痰和夜間痰進行固體培養(yǎng)試驗和PURE-LAMP檢測，培養(yǎng)陽性菌株送至河南省CDC，對每例患者選取生長狀態(tài)最好的1管陽性菌株進行傳代培養(yǎng)和菌群鑒定試驗。

1. 結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[5]中的標準化操作程序，將每份處理后痰標本接種到2支商品化固體改良羅氏培養(yǎng)管中，培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

2. 菌群鑒定：采取PNB法進行菌群鑒定，具體操作參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[6]中的標準化操作程序執(zhí)行。接種后3 d 觀察結(jié)果，以后每周觀察1次，直至孵育4周，同時記錄PNB培養(yǎng)基和中性改良羅氏培養(yǎng)基上菌落生長情況。在PNB培養(yǎng)基上未見菌落生長即為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染，生長則為非結(jié)核分枝桿菌感染。

3. PURE-LAMP檢測：使用PURE-LAMP法熒光檢測試劑盒，按照日本榮研化學(xué)公司提供的標準化操作手冊進行操作[7]。

4.“要素法”成本分析：收集檢測整個過程(從實驗室接收標本到報告結(jié)果和廢棄物處理等)所有直接和間接成本[8]，涉及以下幾方面要素：(1)管理費：維持實驗室正常運轉(zhuǎn)的基本費用，如水、電、辦公費、清潔、廢棄物和垃圾處理、安保等；(2)建筑費：實驗室建筑、改造及維修費用；(3)設(shè)備費：儀器設(shè)備的購買、維修、維護費用；(4)人員費：從事檢測相關(guān)人員工資、福利、津貼費用；(5)試劑費：檢測相關(guān)試劑費用；(6)耗材費：耗材及個人防護相關(guān)費用。

為了有效核算相關(guān)成本，需要針對實驗室檢測的所有步驟和程序分別收集相關(guān)數(shù)據(jù)，進行評估。固體培養(yǎng)試驗包括試劑準備、標本收集登記、培養(yǎng)操作、培養(yǎng)結(jié)果觀察登記和廢棄物處理等步驟。PNB菌群鑒定試驗包括試驗試劑耗材準備、鑒定試驗操作、結(jié)果觀察登記、廢棄物處理等步驟；PURE-LAMP試驗包括試劑準備、前處理及核酸擴增檢測幾個過程。

實驗人員按照要求在3個不同工作日，分別記錄3次高、中和低不同工作量情況下傳統(tǒng)固體培養(yǎng)、PURE-LAMP檢測和PNB菌群鑒定試驗全過程中的資源使用情況，各要素的成本以試驗過程中使用的各要素的數(shù)量乘以各要素的單位價格。其中資本性費用如實驗室空間、建筑物和設(shè)備等，其單位價格根據(jù)其采購價格和預(yù)計的使用年限按照年度折算；管理費用的計算是根據(jù)實驗室工作人員數(shù)量、人員工作時間和其他與該系統(tǒng)相關(guān)的基礎(chǔ)設(shè)施、建筑物的使用狀況，將相關(guān)費用分配到各次檢測中。PURE-LAMP檢測試劑的價格采用項目采購價格106元計算，固體培養(yǎng)和菌群鑒定相關(guān)耗材的價格采用目前市場采購價格。

結(jié) 果

一、每份痰標本固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測成本分析

固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測的單位檢測平均成本分別為51.10和120.90元，均以試劑費和耗材費所占比例較高，新鄉(xiāng)市固體培養(yǎng)檢測成本略高于獲嘉縣，主要是由于新鄉(xiāng)市的管理成本、人員費和耗材費用較高，新鄉(xiāng)市和獲嘉縣PURE-LAMP檢測平均建筑費分別為0.0042和0.0027元(表1)。

二、每例菌株傳代和菌群鑒定試驗成本分析

菌株傳代和PNB菌群鑒定的單位檢測成本分別為21.37和56.68元(表2)。

三、每例患者傳統(tǒng)方法檢測和PURE-LAMP檢測成本分析

傳統(tǒng)方法檢測每例患者是否感染結(jié)核分枝桿菌(2份培養(yǎng)，1份傳代，1份PNB鑒定試驗)需要180.25元，PURE-LAMP檢測每例患者是否感染結(jié)核分枝桿菌需要120.90元，比傳統(tǒng)方法低59.35元。

四、不同檢測準確度及患病流行率不同時， PURE-LAMP檢出每例結(jié)核病患者的成本

計算在不同結(jié)核病患病流行率的可疑人群中，與固體培養(yǎng)試驗相比，不同敏感度和特異度的PURE-LAMP檢出1例結(jié)核病患者的平均成本，平均成本=PURE-LAMP檢測成本/[(1-流行率)×(1-特異度)+流行率×敏感度)]。可疑人群中結(jié)核病流行率越高，應(yīng)用固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測檢出1例結(jié)核病患者的單位成本越低。當PURE-LAMP檢測特異度為95%時，只要敏感度高于60%，在結(jié)核病患病率低于50%的人群中，PURE-LAMP檢出1例結(jié)核病患者的平均成本均低于傳統(tǒng)方法(固體培養(yǎng)和PNB菌群鑒定試驗)(圖1)。

五、PURE-LAMP檢測設(shè)備和試劑耗材價格變化時對單位檢測成本的影響

由于PURE-LAMP檢測設(shè)備和試劑價格在整個成本中占有較大比重，并且對于將來市場推廣具有一定影響，因此在項目使用的設(shè)備及試劑價格基礎(chǔ)上，調(diào)整了50%、80%、100%、120%、150%和200%，分析價格變化對檢測成本的影響。結(jié)果顯示，當LAMP檢測設(shè)備價格分別調(diào)整為現(xiàn)有價格的50%時，單位檢測成本僅下降了0.17元，而當設(shè)備價格為現(xiàn)價格的200%時，單位檢測成本較現(xiàn)有價格僅上升了0.38元，設(shè)備價格的變化對單位檢測的成本影響不大；但是，當調(diào)整檢測試劑為現(xiàn)價格的200%時，單位檢測成本將增加108.86元，達到229.76元，單位檢測成本隨試劑價格的變化幅度比較大。

討 論

本研究采用“要素法”成本分析比較了在我國縣(區(qū))級結(jié)核病實驗室固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測分別用于結(jié)核病診斷的成本。整個研究從衛(wèi)生服務(wù)的角度出發(fā)，分析與固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測相關(guān)的直接和間接的貨幣成本。研究發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)管理費、建筑費和耗材費均顯著高于PURE-LAMP檢測，但是PURE-LAMP檢測設(shè)備和試劑價格較高，導(dǎo)致PURE-LAMP檢測單位成本費用高于固體培養(yǎng)。目前，我國縣(區(qū))級實驗室不具備開展菌群鑒定和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的能力，固體培養(yǎng)陽性菌株需要送到省參比實驗室完成菌群鑒定，導(dǎo)致檢測時間和檢測成本均顯著增加。之前有研究表明，取患者1份痰標本進行PURE-LAMP檢測即可達到很好的檢測效能[7]。因此，本研究中每例患者PURE-LAMP檢測成本按照1份痰標本檢測進行計算。綜合考慮每例結(jié)核病患者的實際診斷情況，PURE-LAMP檢測成本低于固體培養(yǎng)。

一、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測成本影響因素分析

通過此次研究，筆者發(fā)現(xiàn)諸多因素可能會影響到固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測的成本。首先，PURE-LAMP檢測的診斷周期為2 h，而固體培養(yǎng)需要4～8周，這將導(dǎo)致固體培養(yǎng)與時間相關(guān)的成本包括管理費、人員費、儀器費等成本顯著上升；其次，兩個實驗室不同檢測成本也呈現(xiàn)出地域差異，其中新鄉(xiāng)市工作人員工資水平更高，這使得新鄉(xiāng)市的人員成本顯著高于獲嘉縣。此外，兩個項目點管理費用差別也較大，實驗所用耗材為當?shù)刈孕胁少?，因此，在耗材方面兩個實驗室之間也表現(xiàn)出一定的差異。

表1 不同地區(qū)每份痰標本固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測的單位檢測成本(人民幣：元)

表2 河南省CDC進行傳代和PNB菌群鑒定的單位檢測成本(人民幣：元)

Se：敏感度；Sp：特異度

二、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測成本效益比較

除了更低的價格，PURE-LAMP檢測比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)還有諸多優(yōu)勢。首先，PURE-LAMP檢測用時更短。其次，PURE-LAMP檢測采用封閉的反應(yīng)體系，擴增產(chǎn)物無需開蓋通過肉眼觀察就可判讀結(jié)果，降低了污染發(fā)生的可能性。其三，PURE-LAMP檢測更符合生物安全要求；PURE-LAMP檢測是一種基于核酸檢測的方法，因此其安全性優(yōu)于傳統(tǒng)的涂片鏡檢和固體培養(yǎng)。綜合考慮其成本和這些相關(guān)因素，PURE-LAMP檢測是一種更符合成本-效益的結(jié)核分枝桿菌檢測方法。

三、研究局限性

本研究中存在幾個明顯的不足。首先，本研究雖然分析了兩種檢測方法的成本，但由于后期效益(包括患者發(fā)現(xiàn)后治療及傳播風(fēng)險等因素)沒有加以考慮，因此本研究進行的成本-效益分析不夠全面；其次，在分析單個結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)費用時，僅從成本角度考慮，但在實際臨床檢測中，當敏感度低于50%的檢測方法無實際使用價值。因此，后續(xù)深入研究將圍繞如何建立模型評估快速診斷的社會經(jīng)濟效益等方面展開。

總之，本研究表明在目前現(xiàn)有情況下，PURE-LAMP檢測是一種比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)試驗更經(jīng)濟更快速的結(jié)核分枝桿菌檢測方法。如果生產(chǎn)廠商在未來能夠降低市場價格并優(yōu)化產(chǎn)品性能，將更有利于PURE-LAMP檢測在縣(區(qū))級結(jié)核病診斷實驗室的推廣。

志謝河南省CDC、新鄉(xiāng)市結(jié)防所和獲嘉縣CDC工作人員在數(shù)據(jù)收集過程中給予了支持和配合。美國帕斯適宜衛(wèi)生科技組織在數(shù)據(jù)分析和撰寫過程中給予了幫助。Hojoon Sohn在方案設(shè)計中給予了大力幫助

[1] Small PM, Pai M. Tuberculosis diagnosis-time for a game change. N Engl J Med, 2010, 363(11):1070-1071.

[2] Pai M, Kalantri S, Dheda K. New tools and emerging technolo-gies for the diagnosis of tuberculosis: Part Ⅱ. Active tuberculosis and drug resistance. Expert Rev Mol Diagn， 2006, 6(3):423-432.

[3] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res，2000，28(12):63-63.

[4] Boehme CC, Nabeta P, Henostroza G, et al. Operational feasibility of using loop-mediated isothermal amplification for diag-nosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of de-veloping countries. J Clin Microbiol，2007, 45(6):1936-1940.

[5] 趙雁林，王黎霞，成詩明，等. 分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:2.

[6] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會. 結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006.

[7] Mitarai S, Okumura M, Toyota E, et al. Evaluation of a simple loop-mediated isothermal amplification test kit for the diagnosis of TB. Int J Tuberc Lung Dis，2011, 15(9):1211-1217.

[8] Sohn H, Minion J, Albert H, et al. TB diagnostic tests: how do we figure out their costs? Expert Rev Anti Infect Ther，2009, 7(6):723-733.