宋媛媛 蔣明霞 郭占清 夏輝 趙雁林

在我國(guó)基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室使用萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)抗酸染色方法對(duì)痰涂片進(jìn)行染色，應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌仍然是診斷肺結(jié)核的常規(guī)方法。此檢測(cè)方法成本低廉、操作簡(jiǎn)單、特異度較高，但其缺點(diǎn)是敏感度較低。而通過(guò)熒光染色，普通熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌較普通光學(xué)顯微鏡敏感度能提高8%，且特異度與普通光學(xué)顯微鏡相當(dāng)[1]。但普通熒光顯微鏡價(jià)格昂貴，且需要維修費(fèi)用及暗室條件，限制了在我國(guó)的應(yīng)用。發(fā)光二極管(light emitting diodes，LED)熒光顯微鏡可以很好地解決這些問題，并且很多研究也顯示其具有很好的應(yīng)用價(jià)值[1-5]。2011年7月至2011年9月筆者在青海省西寧市7個(gè)縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)研究LED熒光顯微鏡在我國(guó)基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)痰涂片中結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料和方法

一、試劑和材料

研究過(guò)程中，各縣(區(qū))級(jí)結(jié)防機(jī)構(gòu)使用由省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配發(fā)的染色液。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡為奧林巴斯CX21FS1-2，使用100倍物鏡觀察痰涂片。LED熒光顯微鏡為蔡司公司Primo star iLED, 應(yīng)用20倍物鏡觀察痰涂片。

二、研究對(duì)象

研究階段(2011年7月至2011年9月)連續(xù)收集西寧市的城東區(qū)、城中區(qū)、城西區(qū)、城北區(qū)、大通縣、湟源縣、湟中縣7個(gè)縣(區(qū))級(jí)結(jié)防機(jī)構(gòu)就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者，共納入592例(1738份痰標(biāo)本)。有6.42%(38/592)的患者收集到2份痰標(biāo)本，93.58%(554/592)的患者收集到3份痰標(biāo)本。

三、試驗(yàn)方法

每份痰標(biāo)本制作2張涂片，在不同實(shí)驗(yàn)室由1名實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)國(guó)家規(guī)劃要求采用萋-尼染色和熒光染色，并分別用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡檢測(cè),操作方法參見文獻(xiàn)[6]。每份痰標(biāo)本同時(shí)由省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行簡(jiǎn)單法固體羅氏培養(yǎng)，試驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)[7]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)由國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室審核后，雙人雙錄入專門建立的EpiData數(shù)據(jù)庫(kù)中，用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較應(yīng)用兩種顯微鏡檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率；用ROC曲線下面積評(píng)價(jià)兩種顯微鏡診斷肺結(jié)核的價(jià)值。完全無(wú)價(jià)值的診斷試驗(yàn)曲線下面積為0.5，理想的診斷試驗(yàn)曲線下面積為1，而一般認(rèn)為對(duì)于一個(gè)診斷試驗(yàn)，ROC曲線下面積在0.5～0.7之間時(shí)診斷價(jià)值較低，在0.7～0.9之間時(shí)診斷價(jià)值中等，在0.9以上時(shí)診斷價(jià)值較高[8]；用t檢驗(yàn)對(duì)檢出時(shí)間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

五、質(zhì)量控制

在研究工作正式開始前對(duì)所有操作人員開展為期1周的培訓(xùn)，并經(jīng)熟練度測(cè)試合格后試運(yùn)行1個(gè)月，然后正式開始研究。各研究點(diǎn)統(tǒng)一使用由省級(jí)配制的染色液，染色液發(fā)放之前已經(jīng)通過(guò)質(zhì)量控制合格。對(duì)于同一張涂片的兩種鏡檢方法采用盲法進(jìn)行操作。培養(yǎng)基由省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室自行配制，經(jīng)過(guò)無(wú)菌測(cè)試合格后使用。

結(jié) 果

一、傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡與LED熒光顯微鏡兩種方法對(duì)痰涂片的陽(yáng)性檢出率比較

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡的涂片陽(yáng)性檢出率分別為13.75%(239/1738)和14.90%(259/1738)，后者較前者提高1.15個(gè)百分點(diǎn)，兩種鏡檢方法的陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.88，P<0.05)。

二、傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡與LED熒光顯微鏡兩種方法對(duì)診斷肺結(jié)核患者的價(jià)值比較

培養(yǎng)是細(xì)菌學(xué)診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，因此研究中對(duì)每份痰標(biāo)本都做了簡(jiǎn)單法固體羅氏培養(yǎng)試驗(yàn)，共計(jì)1738份，其中有2份培養(yǎng)污染，不計(jì)入分析。以培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步分析傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果的準(zhǔn)確性，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡敏感度為79.60%(199/250，95%CI=74.60%～84.60%)，特異度為97.31%(1446/1486，95%CI=96.49%～98.13%)。LED熒光顯微鏡敏感度為84.80%(212/250， 95%CI=80.30%～89.25%),特異度為96.84%(1439/1486， 95%CI=95.95%～97.73%)(表1)。

每份痰標(biāo)本兩種顯微鏡的鏡檢結(jié)果分別與培養(yǎng)結(jié)果比較繪制診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線(圖1，2)。從表2可見，用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡診斷肺結(jié)核患者時(shí)ROC曲線下面積為0.8878(95%CI=0.8623～0.9133)，與完全無(wú)價(jià)值的診斷試驗(yàn)曲線下面積0.5相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=29.8308,P<0.01)；LED熒光顯微鏡ROC曲線下面積為0.9118(95%CI=0.8890～0.9347)，與0.5相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=35.1966,P<0.01)。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡兩種鏡檢方法均具有中高度的診斷價(jià)值，LED熒光顯微鏡具有更高的診斷價(jià)值。對(duì)兩種方法的曲線下面積進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.4236，P<0.05)，即兩種方法的診斷價(jià)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡讀片時(shí)間分析

比較兩種鏡檢方法在閱讀不同級(jí)別涂片所花費(fèi)的時(shí)間(表3)，成組分析兩種方法的讀片時(shí)間可見，LED熒光顯微鏡的平均讀片時(shí)間明顯短于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.32,P<0.01)，除結(jié)果為實(shí)際細(xì)菌條數(shù)的涂片外，其他各陽(yáng)性級(jí)別涂片兩種方法的讀片時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線下面積

圖1 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線

圖2 LED熒光顯微鏡診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線

表3不同鏡檢結(jié)果采用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡與LED熒光顯微鏡的讀片時(shí)間比較

鏡檢結(jié)果標(biāo)本量(份)讀片時(shí)間(s，x±s)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡LED熒光顯微鏡傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡LED熒光顯微鏡t值雙側(cè)近似P值陰性12161133186 100±73 779150 000±57 62513 230<0 011～8條/300視野、1～9條/50視野2536261 320±169 851207 420±69 5101 502>0 05陽(yáng)性+6656217 620±114 705157 000±53 4143 832<0 01陽(yáng)性++5942149 120±35 785113 740±55 4743 630<0 01陽(yáng)性+++3052147 200±57 54472 020±36 2086 456<0 01陽(yáng)性++++2149117 800±82 38350 330±38 9023 586<0 01合計(jì)14171368185 600±79 271144 190±62 17315 320<0 01

討 論

本研究中評(píng)價(jià)了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡與LED熒光顯微鏡兩種鏡檢方法對(duì)痰涂片的陽(yáng)性檢出率差異，據(jù)文獻(xiàn)[1,3,9-12]報(bào)道LED熒光顯微鏡比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡陽(yáng)性檢出率增加值范圍多數(shù)在0%～33%，其中一篇系統(tǒng)的回顧性研究中得出陽(yáng)性檢出率平均增加值為9%(95%CI=5%～13%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1]。本研究結(jié)果顯示LED熒光顯微鏡比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡涂片陽(yáng)性檢出率提高1.15個(gè)百分點(diǎn)。兩種鏡檢方法的總體檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.88，P<0.05)，與文獻(xiàn)[1,3,9-12]研究結(jié)果相符。

以簡(jiǎn)單法固體羅氏培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步分析傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡、LED熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有學(xué)者研究表明LED熒光顯微鏡比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡敏感度最多提高到39.32%，最低降低到9%；特異度最多提高到1.00%，最多降低到8.4%[2-4,9,12-13]；其中一篇系統(tǒng)的回顧性研究中得出敏感度平均增加8%,特異度平均無(wú)變化，為0%[1]。本研究得出的結(jié)果與文獻(xiàn)[1-4，9,12-13]結(jié)果一致。因此，可得出“LED熒光顯微鏡診斷肺結(jié)核較傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡有更高的敏感度，而特異度相當(dāng)”。

每份痰標(biāo)本兩種顯微鏡的鏡檢結(jié)果分別與培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較繪制診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和LED熒光顯微鏡兩種鏡檢方法均具有中高度的診斷價(jià)值，LED熒光顯微鏡具有更高的診斷價(jià)值，兩種方法的診斷價(jià)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.4236，P<0.05)。因此，LED熒光顯微鏡替代傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡可以提高診斷肺結(jié)核的價(jià)值。

LED熒光顯微鏡較傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡讀片時(shí)間明顯縮短(節(jié)省22.31%時(shí)間)。但同時(shí)需要注意的是，國(guó)際上推薦用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡平均讀片時(shí)間為5～10 min[14]，但實(shí)際我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室工作量大，工作人員熟練程度高，他們的讀片時(shí)間一般在2～5 min。有研究表明，如果用10 min的時(shí)間重新觀察陰性涂片，會(huì)提高50%的陽(yáng)性檢出率[15]。但是如果每張涂片觀察10 min，在我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。本研究中使用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的平均讀片時(shí)間為185.6 s，讀片時(shí)間較短也是導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性檢出率低的一個(gè)因素?？紤]到實(shí)驗(yàn)室人員使用LED熒光顯微鏡時(shí)間較短，熟練程度還不夠高，這也對(duì)讀片時(shí)間差異有一定影響。對(duì)于工作負(fù)荷重的實(shí)驗(yàn)室，使用LED熒光顯微鏡可以節(jié)約人力時(shí)間，減輕工作負(fù)荷。

從本研究結(jié)果可以看出，LED熒光顯微鏡與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比較，痰涂片陽(yáng)性檢出率明顯提高，且具有更高的敏感度，但特異度相當(dāng)，診斷肺結(jié)核患者的價(jià)值更高，讀片時(shí)間明顯縮短。使用LED熒光顯微鏡對(duì)人員教育背景、工作經(jīng)驗(yàn)等無(wú)特殊要求，現(xiàn)有的從事實(shí)驗(yàn)室鏡檢的工作人員經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并熟練掌握后均可以開展工作。生物安全要求與現(xiàn)有涂片鏡檢方法相同，維護(hù)成本較低。但在推廣使用時(shí)應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員掌握的熟練程度情況予以重視，并需完善現(xiàn)有的熒光涂片質(zhì)量控制體系，以便更好地開展盲法復(fù)檢工作。LED熒光顯微鏡在我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室有一定的推廣和應(yīng)用價(jià)值，建議推廣使用前進(jìn)行擴(kuò)大樣本量研究，并做相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。

志謝感謝青海省疾病預(yù)防控制中心、西寧市疾病預(yù)防控制中心及西寧市七縣(區(qū))疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作人員在研究現(xiàn)場(chǎng)的辛勤工作！

[1] Steingart KR,Henry M,Ng V,et al. Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis:a syste-matic review. Lancet Infect Dis,2006,6(9):570-581.

[2] Cuevas LE, Al-Sonboli N, Lawson L,et al. LED fluorescence microscopy for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a multi-country cross-sectional evaluation.PLoS Med，2011,8(7):e1001057.

[3] Chaidir L, Parwati I, Annisa J, et al. Implementation of LED fluorescence microscopy for diagnosis of pulmonary and HIV-associated tuberculosis in a hospital setting in Indonesia.PLoS One，2013，8(4):e61727.

[4] World Health Organization. Fluorescent light-emitting diode (LED) microscopy for diagnosis of tuberculosis policy.WHO/HTM/TB/2011.8.http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241501613_eng.pdf?ua=1.

[5] Khatun Z,Kamal M,Roy CK, et al. Usefulness of light emitting diode (LED) fluorescent microscopy as a tool for rapid and effective method for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Bangladesh Med Res Counc Bull,2011，37(1):7-10.

[6] 趙雁林.痰涂片顯微鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè).北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009:7.

[7] 趙雁林. 分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:4.

[8] 余松林.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.

[9] Trusov A, Bumgarner R, Valijev R,et al.Comparison of lu-min LED fluorescent attachment, fluorescent microscopy and Ziehl-Neelsen for AFB diagnosis. Int J Tuberc Lung Dis，2009，13(7):836-841.

[10] Habtamu M, van den Boogaard J, Ndaro A, et al. Light-emitting diode with various sputum smear preparation techniques to diagnose tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis，2012，16(3):402-407.

[11] Xia H, Song YY, Zhao B, et al. Multicentre evaluation of Ziehl-Neelsen and light-emitting diode fluorescence microscopy in China.Int J Tuberc Lung Dis，2013，17(1):107-112.

[12] Khatun Z, Kamal M, Roy CK,et al.Usefulness of light emitting diode (LED) fluorescent microscopy as a tool for rapid and effective method for the diagnosis of pulmonary tuberculosis.Bangladesh Med Res Counc Bull，2011，37(1):7-10.

[13] Bonnet M, Gagnidze L, Githui W,et al. Performance of LED-based fluorescence microscopy to diagnose tuberculosis in a peripheral health centre in Nairobi.PLoS One, 2011,6(2):e17214.

[14] International Union Against Tuberculosis and Lung Disease(IUATLD) technical guide.Sputum examination for tuberculosis by direct microscopy in low-income countries.5th ed. Paris: IUATLD,2000.

[15] Cambanis A, Ramsay A, Wirkom V,et al.Investing time in microscopy: an opportunity to optimise smear-based case detection of tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2007，11(1):40-45.