齊明華 劉吉奎 葉 靜 漆正宇 萬(wàn)匯涓 李明華 余光銀 尹耀新 歐 希

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院感染性疾病科(廣東 深圳，518036) 2.深圳醫(yī)院肝膽外科 3.深圳醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 4.深圳醫(yī)院病理科

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病率和死亡率都很高的疾病，全世界每年平均約有25 萬(wàn)人死于肝癌，高居腫瘤死亡人數(shù)第5位;原發(fā)性肝癌也是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在我國(guó)消化系統(tǒng)惡性腫瘤中居第3 位，占世界肝癌死亡病例的45%［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，組織通過(guò)自分泌和旁分泌產(chǎn)生的局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。RAS 的ACE-Ang 2-AT1 受體軸和ACE2-AngⅠ-7-Mas 受體軸中，Ang2 為血管緊張素2 (angiotensin 2)，而AngⅠ-7 為血管緊張素1 的降解產(chǎn)物7 肽(angiotensin1-7)。這兩個(gè)受體軸都能影響腫瘤增生和轉(zhuǎn)移，但作用相反。ACE-Ang 2-AT1 受體軸起促進(jìn)腫瘤增生和轉(zhuǎn)移的作用，例如，AT1 受體表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤侵襲正相關(guān)［2］，而且ACE 抑制劑可以顯著減少小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［3］。ACE2-AngⅠ-7-Mas 受體軸則對(duì)腫瘤增生和轉(zhuǎn)移起抑制作用，研究表明，ACE2 在小細(xì)胞肺癌和胰腺癌癌巢組織表達(dá)下調(diào)，使ACE2 基因靜默，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生［4］。用AngⅠ-7 處理肺癌接種模型的體內(nèi)試驗(yàn)表明，AngⅠ-7 可以減少肺癌腫瘤細(xì)胞增生［5］。

我們通過(guò)比較肝癌患者癌組織與癌旁組織ACE、ACE2 及其受體AT1、MAS 基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，初步揭示ACEAng2-AT1 受體軸和ACE2-AngⅠ-7-Mas 受體軸在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中相互制約從而達(dá)到平衡的現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 一般材料 實(shí)驗(yàn)中6 例份肝癌和癌旁標(biāo)本均為我院2010年和2011年手術(shù)切除標(biāo)本，病理學(xué)資料齊全?；颊呔唇邮芊呕?，臨床資料見(jiàn)表1。

表1 患者的臨床及病理資料

1.2 試劑 Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司。RT-PCR 試劑盒及SYBRGreen qPCR 試劑盒均購(gòu)自Fermantas 公司。ACE、ACE2、AT1 及MAS 引物由上海生工公司合成，見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)中用到的引物序列

1.3 方法 分別稱(chēng)取-80℃冰箱保存的12 例配對(duì)組織標(biāo)本各100mg。Trizol 法提取組織總RNA，經(jīng)酚氯仿抽提純化。用紫外分光光度儀測(cè)定A260/A280 值均在1.9～2.0 之間，RNA純度較好。使用Fermantas 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，oligo (dT)為引物，按標(biāo)準(zhǔn)流程合成cDNA。

RT-qPCR 的ΔΔCT 法相對(duì)定量ACE、ACE2 及其受體AT1、MAS 基因的轉(zhuǎn)錄水平。采用Fermantas 熒光定量試劑盒，按標(biāo)準(zhǔn)流程，二步法在ABI Prism 7000 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，95℃初步變性10min，95℃變性15s，60℃延伸30s，共30 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)內(nèi)參為18s RNA。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) ΔCT 癌巢/ΔCT 癌旁 ＞1 表明癌巢表達(dá)較癌旁高，＜1 表明癌巢表達(dá)較癌旁低。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)顯示，相對(duì)于癌旁組織，癌巢組織中ACE 與ACE2的基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)一致，協(xié)同升高或降低;ACE 和AT1 的基因轉(zhuǎn)錄水平變化一致，協(xié)同升高或降低。但ACE2 與其受體MAS 的基因轉(zhuǎn)錄水平一致性不好，只有E 和F1 兩例病人的癌巢組織/癌旁組織趨勢(shì)一致，分別為協(xié)同降低，其他病例表達(dá)不一致。見(jiàn)圖1 及圖2。

圖1 癌巢組織/癌旁組織ACE 與ACE2的基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)一致

圖2 癌巢組織/癌旁組織ACE 與AT1的基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)一致

3 討論

以往，人們認(rèn)為腎素-血管緊張素(RAS)主要作用是調(diào)控血壓，調(diào)節(jié)水鹽平衡。近年來(lái)，不論是臨床研究，還是動(dòng)物試驗(yàn)，以及體外研究均發(fā)現(xiàn)，RAS 在惡性腫瘤中表達(dá)失衡，而且與預(yù)后密切相關(guān)。RAS 的拮抗劑可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管形成，回顧性臨床研究則發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期口服ACE 抑制劑可以預(yù)防腫瘤。而且這種作用與RAS 的降壓作用無(wú)關(guān)［7～11］。

隨后的深入研究主要在對(duì)AT1 受體的表達(dá)與癌癥的關(guān)系方面，研究表明，在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和胰腺癌及胃腸道腫瘤中，AT1 的表達(dá)均異常，且這種異常源于這些組織原本在正常生理活動(dòng)中起作用的局部的RAS 組分［11］。

但是，目前原發(fā)性肝細(xì)胞癌中RAS 組分表達(dá)情況的研究尚未見(jiàn)到。本文首次從臨床標(biāo)本入手，通過(guò)自身對(duì)照，研究原發(fā)性肝細(xì)胞癌癌組織和癌旁組織RAS 主要組分的表達(dá)情況，為探討RAS 與原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生、生長(zhǎng)的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。自體癌組織和癌旁組織對(duì)照，較好地平衡了個(gè)體間差異。

RAS 復(fù)雜的組分中，ACE-Ang 2-AT1 受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸是兩個(gè)主要的調(diào)控系統(tǒng)，在惡性腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起到調(diào)控作用。本文首次探討了ACE-Ang2-AT1受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的相互作用規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于癌旁組織，癌巢組織中ACE 與ACE2 的基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)一致，協(xié)同升高或降低;ACE/AT1 的基因轉(zhuǎn)錄水平變化一致，協(xié)同升高或降低，提示原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者中，ACE-Ang 2-AT1 受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸的調(diào)控作用是彼此制約，當(dāng)ACE表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，ACE2 代償性升高，從而達(dá)到平衡;而ACE 表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)，AT1 表達(dá)也增強(qiáng)，反之降低，說(shuō)明ACE 可能是通過(guò)AT1 起到調(diào)控作用的。

在具體的RAS 組分與腫瘤的關(guān)系中，研究最多的是AT1受體同腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，這方面乳腺癌的研究較深入。有研究顯示，有約占10%～20%的乳腺癌中，AT1表達(dá)明顯增高［12，13］，而且，AT1 表達(dá)與腫瘤進(jìn)展過(guò)程中不同階段有關(guān)，比如在增生及原位癌階段，AT1 在乳腺癌中的表達(dá)較高，而在侵襲性階段則降低［14］。

我們首次關(guān)注AT1 在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的基因表達(dá)情況，在癌巢中呈高表達(dá)的有3 個(gè)病例:病例A，D，F(xiàn);在癌巢中呈低表達(dá)的有3 個(gè)病例:病例B，C，E，各占50%。高轉(zhuǎn)錄水平的3 個(gè)病例中有1 例出現(xiàn)血管侵犯，2 例無(wú)血管侵犯;低表達(dá)的3 個(gè)病例中，也是有1 例出現(xiàn)血管侵犯，2 例無(wú)血管侵犯，差異不明顯。但觀(guān)察高轉(zhuǎn)錄水平病例中，有2 例腫瘤較小，1 例腫瘤較大;低表達(dá)病例則是3 例腫瘤較大，似乎AT1轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)，AT1 轉(zhuǎn)錄水平低，腫瘤體積大。4例腫瘤大小評(píng)分為2 的病例，即B，C，D，E 中，肝內(nèi)腫瘤的個(gè)數(shù)在B，E 中為3，AT1 低轉(zhuǎn)錄水平為100%;C，D 病例中肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤個(gè)數(shù)為2，AT1 低轉(zhuǎn)錄水平為50%。提示相同原發(fā)癌灶大小的情況下，AT1 轉(zhuǎn)錄低水平可能更有利于肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，與乳腺癌研究中AT1 在增生及原位癌階段的表達(dá)較高，而在侵襲性階段則降低的研究結(jié)論一致［14］。ACE2 和MAS 的基因轉(zhuǎn)錄水平不一致，這可能是因?yàn)镸AS 基因轉(zhuǎn)錄水平受影響轉(zhuǎn)多，而且目前MAS 的蛋白結(jié)構(gòu)還沒(méi)有完全得到確認(rèn)，嚴(yán)格意義上，它作為受體的作用還沒(méi)有完全確認(rèn)，人們對(duì)于它的了解相當(dāng)有限。

本研究雖然病例較少，但因?yàn)镽AS 系統(tǒng)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的關(guān)系是首次探索，因此具有較好的創(chuàng)新性，今后的研究可以擴(kuò)大樣本量，并延伸到蛋白水平，進(jìn)一步確證ACEAng2-AT1 受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的變化規(guī)律，及AT1 受體在原發(fā)性肝細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移方面的作用。

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