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(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

miRNA是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的非編碼RNA,長度約為22nt。自1993年Lee等人[1]首先發(fā)現(xiàn)lin - 4基因表達(dá)的一種小RNA(lin - 4 RNA)以來,至今已報(bào)道的miRNA達(dá)到上萬種。研究表明,miRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用,如動物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和變態(tài)發(fā)育等生理過程與一些miRNA的表達(dá)有關(guān)[2 - 4]。另外,在疾病治療,特別是癌癥治療中,miRNA作為標(biāo)記物或基因藥物也發(fā)揮了重要作用[5 - 7]。近期Zhang等人[8]以小鼠作為研究對象,對經(jīng)口服攝入的植物miRNA的功能進(jìn)行研究,驚喜的發(fā)現(xiàn)大米中的miRNA可以通過攝食在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定存在,并發(fā)揮生理調(diào)節(jié)功能,miRNA因此被稱作攝入的“信息”而再次引起關(guān)注。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,一些靶基因預(yù)測軟件如TargetScan[9]、PicTar[10]、miRanda[11]和DIAN -microT[12]等,實(shí)現(xiàn)了對大量新的miRNA的預(yù)測[13]。然而,如需驗(yàn)證新預(yù)測的miRNA或研究已知miRNA表達(dá)量與功能間的關(guān)系,必須對其建立高效準(zhǔn)確的定量方法。RNA印跡雜交法(Lee等[14])和基因芯片(Sun等[15])是研究miRNA表達(dá)的主要傳統(tǒng)方法,但樣品需求量大、線性范圍和靈敏度有限(見表1)的突出缺陷限制了其應(yīng)用。隨著實(shí)時(shí)定量PCR(real time- quantitative PCR,RT - qPCR)技術(shù)的出現(xiàn),推動了核酸定量的革命性進(jìn)步,該法已廣泛用于食品中微生物、致病菌的檢測與定量和農(nóng)業(yè)中植物致病菌檢測等生物技術(shù)領(lǐng)域[16 - 17]。miRNA的檢測也因此獲益,依托該技術(shù)建立的miRNA測定方法應(yīng)運(yùn)而生。表1列舉了現(xiàn)有的幾種miRNA常用定量方法,比較顯示,RT - qPCR具備更簡便、快速、定量濃度范圍廣,以及特異性高等諸多優(yōu)勢。

表1 miRNA定量方法比較[18]Table 1 Comparison of miRNA quantification methods[18]

由于miRNA只有22nt左右的長度,反轉(zhuǎn)錄后不能直接應(yīng)用RT - qPCR對其進(jìn)行擴(kuò)增。2005年,Chen等人[19]發(fā)明了基于莖環(huán)引物的miRNA定量方法,在PCR前有效的對其進(jìn)行了長度的延長,使RT - qPCR技術(shù)真正應(yīng)用到了miRNA的定量檢測中。經(jīng)過不斷改進(jìn),該方法發(fā)展迅速,已經(jīng)成為目前在生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域定量miRNA最為重要的技術(shù)手段。本文將系統(tǒng)介紹該技術(shù)自建立近十年來在引物設(shè)計(jì)、多重定量、熒光標(biāo)記等方面的發(fā)展及其應(yīng)用情況,對之原理及關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行綜述,以期對miRNA的定量檢測的應(yīng)用和發(fā)展有所幫助。

1 基于莖環(huán)引物的RT - qPCR法定量單一miRNA

RT - qPCR是基于莖環(huán)引物的miRNA定量檢測中使用的核心技術(shù),它是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸定量技術(shù),由美國PE公司于1995年推出,Heid等人[20]首先對之原理和方法進(jìn)行了報(bào)道。它實(shí)現(xiàn)了核酸PCR由定性到定量的跨越,引起了研究人員的廣泛關(guān)注。

RT - qPCR的關(guān)鍵是在PCR反應(yīng)體系里添加可以產(chǎn)生熒光信號的分子,通過實(shí)時(shí)測定體系熒光信號監(jiān)測目的片段的PCR反應(yīng)進(jìn)程。熒光域值(threshold)和循環(huán)域值(Ct)是RT - qPCR中的兩個重要參數(shù)[21]。熒光域值,也稱本底信號,一般默認(rèn)設(shè)置為反應(yīng)3 ～ 15循環(huán)后熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的十倍以上,信號在達(dá)到此域值前被背景信號掩蓋。Ct值是每個反應(yīng)體系的熒光信號達(dá)到熒光域值所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。Ct值與體系內(nèi)起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)一般成線性相關(guān),據(jù)此可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,以實(shí)現(xiàn)對未知樣品起始模板數(shù)的定量。根據(jù)體系中熒光標(biāo)記原理不同,RT - qPCR分為探針類和染料類。在定量miRNA的過程中主要應(yīng)用Taqman探針法和SYBR Green I法。

使用RT - qPCR技術(shù)定量miRNA的瓶頸問題是其長度較短,無法實(shí)現(xiàn)直接PCR擴(kuò)增,因此世界各國的科學(xué)家提出了多種長度延伸的方案,如基于poly A聚合酶加尾法[22]、LNA技術(shù)的引物延伸法[23]、基于莖環(huán)引物(Stem - loop Primer)的RT - qPCR法(SLP - RT- qPCR)等。其中基于莖環(huán)(Stem - loop)引物的RT -qPCR法在定量miRNA過程中具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、miRNA前體的背景干擾小、線性范圍廣、效率高等優(yōu)點(diǎn)。后經(jīng)過科研人員的不斷改進(jìn),在目前miRNA和siRNA等類似小RNA的研究中頗受青睞[24 - 28]。

1. 1 SLP - RT - qPCR對單一miRNA定量原理

圖1描述了SLP - RT - qPCR技術(shù)的操作原理,分為逆轉(zhuǎn)錄和qPCR兩個過程。如圖所示,依據(jù)靶標(biāo)miRNA特別設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物3′ - 端有6 ～ 8nt堿基與靶miRNA 3′ - 端互補(bǔ),通過其與miRNA的特異性互補(bǔ)結(jié)合挑選模板,作為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。即miRNA與特異性莖環(huán)引物結(jié)合后逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA,作為下一步PCR擴(kuò)增的模板。在PCR擴(kuò)增中使用特異性上游引物和與莖環(huán)部位相對應(yīng)的通用下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。特異性上游引物的一部分與miRNA具有相同的序列。依據(jù)不同發(fā)光原理,特異性熒光探針或通用熒光染料在cDNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生熒光信號,通過監(jiān)測信號達(dá)到定量或半定量的目的。

圖1 基于莖環(huán)引物的RT - qPCR原理Fig. 1 The principle of RT - qPCR based on Stem - loop primer

在整個定量過程中,高效、特異性地將目的miRNA全部逆轉(zhuǎn)錄是后續(xù)成功定量的前提,莖環(huán)引物解決了短鏈模板不能PCR擴(kuò)增的難題,并保證了高靈敏性,是之后RT - qPCR應(yīng)用的關(guān)鍵。

1. 2 莖環(huán)引物(Stem - loop Primer)

成熟miRNA的長度僅為22nt左右,普通的線性PCR引物由于長度的限制,無法用于miRNA擴(kuò)增。莖環(huán)引物的出現(xiàn),有效地彌補(bǔ)了普通引物的缺陷。針對miRNA設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物持有莖 - 環(huán)狀結(jié)構(gòu),保證了特異性的同時(shí)延長了miRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物的長度,以利于其擴(kuò)增。Chen等人[19]設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物(5′ - GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGAC - 3')構(gòu)造如圖2所示,其總長度在50nt左右,由一段與miRNA特異性互補(bǔ)序列和一段較長的通用序列組成。

莖環(huán)引物3′ - 端有一段與miRNA特異性互補(bǔ)的堿基序列(一般為6 ～ 8nt),這是區(qū)別相似miRNA,保證特異性的第一步,PCR過程中特異性上游引物是保證擴(kuò)增特異性的第二步。圖2中兩段莖柄區(qū)序列堿基互補(bǔ),形成莖環(huán)的柄部。柄部的堿基堆積使miRNA的穩(wěn)定性增加,提高了逆轉(zhuǎn)錄效率。其雙鏈結(jié)構(gòu)和自身互補(bǔ)形成莖環(huán)構(gòu)象,可避免逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA前體及同源RNA發(fā)生雜交,減少背景干擾,若結(jié)合TaqMan探針可達(dá)到區(qū)分單個堿基差異的效果[19]。莖環(huán)引物的環(huán)中還包括了一段PCR過程中的通用下游引物序列(5′ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3′),它和上游引物一起完成PCR擴(kuò)增。在莖環(huán)引物的序列中還特別插入較多G/C堿基,提高其退火溫度,減少PCR非特異性擴(kuò)增。

圖2 莖環(huán)引物構(gòu)造Fig. 2 The structure of Stem-loop Primer

在Chen等人設(shè)計(jì)的序列基礎(chǔ)上,為設(shè)計(jì)通用探針,使該法操作更加簡單,Mohammadi等人[29]對上述序列進(jìn)行了優(yōu)化,設(shè)計(jì)新序列(5′ - GGTC GTATGCAAAGCAGGGTCCGAGGTATCCATCGCACGC ATCGCACTGCATACGACC - 3′),將長度延伸14nt,使環(huán)部增長并提高了莖部退火溫度,設(shè)計(jì)通用TaqMan探針,省去實(shí)驗(yàn)過程中分別為每種miRNA設(shè)計(jì)特異探針的步驟,節(jié)省時(shí)間降低實(shí)驗(yàn)成本。經(jīng)驗(yàn)證,該序列在miRNA檢測中可以保證良好的特異性與靈敏度,對部分miRNA的檢測限可達(dá)每微升6個拷貝。

2 基于莖環(huán)引物的多重RT - qPCR法同時(shí)定量多種miRNA

越來越多的研究表明,miRNA的種類數(shù)量非常龐大。Bentwich等[30]通過生物信息學(xué)預(yù)測分析和基因芯片驗(yàn)證等方法發(fā)現(xiàn),僅人體miRNA的數(shù)量就超過800種?；蛐酒窃谝粋€反應(yīng)中同時(shí)分析多個miRNA的常用方法,但就目前的技術(shù)水平它對RNA的用量要求很高(一般超過1μg),然而一般提取方法從少量樣品(如癌細(xì)胞等)中得到的RNA量無法滿足這種需求。為使RT - qPCR法實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量多種miRNA,同時(shí)降低對樣品RNA需求的目的,Tang等人[31]應(yīng)用基于莖環(huán)引物的RT - qPCR方法對單個胚胎干細(xì)胞中220種miRNA表達(dá)進(jìn)行同時(shí)檢測,成功實(shí)現(xiàn)了多重定量。Lao等人[32]對Tang等的方法進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證,并對小量樣品中的多種miRNA同時(shí)進(jìn)行檢測,證實(shí)了其可行性。

圖3展示了多重RT - PCR同時(shí)定量多種miRNA的過程。全過程主要包括兩大部分,即使用不同莖環(huán)引物同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄所有目的miRNA和特異性定量目標(biāo)cDNA。細(xì)胞裂解得到的總miRNA在同一體系內(nèi)同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(根據(jù)需要測定的miRNA種類分別設(shè)計(jì)莖環(huán)引物),逆轉(zhuǎn)錄得到的全部cDNA用特異的上游引物(根據(jù)需要檢測的目的miRNA分別進(jìn)行設(shè)計(jì))和通用下游引物同時(shí)進(jìn)行一次預(yù)擴(kuò)增反應(yīng),最后分別針對目的miRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物加入相應(yīng)的熒光探針或染料單獨(dú)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。

圖3 多重RT - qPCR定量多種microRNA過程Fig. 3 Multiplexing RT - qPCR for the detection of multiple microRNAs

相較于單重定量反應(yīng),多重定量過程中采用循環(huán)脈沖逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并增加預(yù)擴(kuò)增過程,以保證逆轉(zhuǎn)錄效率且提高檢測的靈敏度[31]。

2. 1 循環(huán)脈沖逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

一般條件下,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)要在逆轉(zhuǎn)錄酶最適溫度下孵育半小時(shí),來保證逆轉(zhuǎn)錄效果。在多重反應(yīng)體系中,體系復(fù)雜,不同引物間和不同miRNA間發(fā)生非特異性結(jié)合的概率大,且逆轉(zhuǎn)錄效率也較單重反應(yīng)低。Tang等人[31]設(shè)計(jì)引入的循環(huán)脈沖溫育(20℃,30s;42℃,30s;50℃,1s;60個循環(huán)),增加了逆轉(zhuǎn)錄效率,并且減少引物間和不同miRNA間的非特異性擴(kuò)增。相較于普通逆轉(zhuǎn)錄,它將各產(chǎn)物的Ct值降低1左右,提高了檢測的靈敏度。逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物濃度降低為單重反應(yīng)的2% ～ 10%,進(jìn)一步減少了引物間的非特異性結(jié)合。

2. 2 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)

在多重定量反應(yīng)中,預(yù)擴(kuò)增是非常重要的一步。為提高檢測的靈敏度,在進(jìn)行定量之前,需將所有cDNA進(jìn)行PCR,使各cDNA得到同數(shù)量的擴(kuò)增,為后續(xù)定量提供更多模板。為驗(yàn)證所有的cDNA是否都以相對統(tǒng)一的效率擴(kuò)增,Lao等人[32]將逆轉(zhuǎn)錄整體cDNA產(chǎn)物分別進(jìn)行1、5、10、14個循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增后分別對48種和190種miRNA分別進(jìn)行定量,Ct值結(jié)果顯示,適當(dāng)預(yù)擴(kuò)增未產(chǎn)生明顯偏差,各cDNA相對擴(kuò)增效率相同。Mestdagh等人[33]對上述結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證,預(yù)擴(kuò)增大大提高了檢測的靈敏度,降低了檢測所需要的RNA數(shù)量,且未偏離含量的真實(shí)水平。預(yù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)控制在14以內(nèi)為宜,當(dāng)循環(huán)數(shù)過高時(shí),不同miRNA的cDNA擴(kuò)增效率產(chǎn)生的偏差增大,模板數(shù)擴(kuò)增量不同,產(chǎn)生的PCR模板不能真實(shí)反映樣品中miRNA含量情況。

3 SLP - RT - qPCR定量miRNA的應(yīng)用

目前針對miRNA相關(guān)研究正在不斷深入,其在多種疾病,特別是癌癥的診斷與治療方面發(fā)揮了多種功能。癌癥等重大疾病的發(fā)作往往伴隨著miRNA表達(dá)量的改變,使之可作為疾病標(biāo)記物或診斷依據(jù)。SLP - RT - qPCR作為一種理想的miRNA定量方法,既可以對單一miRNA進(jìn)行定量也可以實(shí)現(xiàn)多重定量,在定量癌細(xì)胞等動物樣本miRNA表達(dá)量的研究中廣泛應(yīng)用。除了病理過程,miRNA還參與了生物體內(nèi)其他多種生理過程,如變態(tài)發(fā)育、組織分化等。它們在這些過程中的作用大小與其表達(dá)量直接相關(guān),SLP - RT - qPCR多與高通量測序等技術(shù)結(jié)合使用,系統(tǒng)研究miRNA表達(dá)情況。

Xu等人[34]用SLP - RT - qPCR對52名結(jié)腸直腸癌患者的癌細(xì)胞組織中miR - 21,miR - 31等四種miRNA表達(dá)進(jìn)行了定量檢測發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,腫瘤細(xì)胞內(nèi)這四種miRNA表達(dá)量明顯增加。Li等人[35]用同樣方法對38個乳腺癌樣本和正常樣本中miR - 26b表達(dá)量定量檢測發(fā)現(xiàn),乳腺癌樣本中該miRNA表達(dá)量明顯降低,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR -26b有可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞生長,為乳腺癌治療提供幫助。Luo等人[36]對喉鱗狀細(xì)胞癌中miR - 139表達(dá)量定量檢測結(jié)合相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),miR - 139可以抑制CXCR4表達(dá),進(jìn)而起到抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的作用。

除了直接定量相關(guān)miRNA表達(dá)量,由于SLP -RT - qPCR法準(zhǔn)確、靈敏的檢測能力,常被用于驗(yàn)證高通量測序得到的miRNA表達(dá)譜結(jié)果。Wei等人[37]采用深度測序技術(shù)系統(tǒng)地建立了催乳素治療或未被治療的乳腺癌T - 47D細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,并選取4種已知miRNA采用SLP - RT - qPCR法定量檢測,驗(yàn)證了測序結(jié)果的可靠性。

4 SLP - RT - qPCR定量miRNA的發(fā)展

SLP - RT - qPCR技術(shù)雖然僅僅發(fā)明了十年時(shí)間,但是已經(jīng)經(jīng)歷了大量的革新和進(jìn)步。其發(fā)展主要體現(xiàn)在莖環(huán)引物的設(shè)計(jì)、多重定量方法的建立以及RT - qPCR技術(shù)中使用的新型探針/染料的研發(fā)等方面。前兩個方面已有提及和論述,這里我們重點(diǎn)介紹一下用于定量的探針/染料的發(fā)展。多種新熒光標(biāo)記的出現(xiàn)及應(yīng)用,使該技術(shù)的結(jié)果呈現(xiàn)方式更加靈活,其中UPL(Universal Probe Library)通用探針和SYBR Green I等更加快捷、低成本的熒光指示物替代TaqMan探針,降低了定量檢測成本且實(shí)驗(yàn)操作更加簡便。

4. 1 UPL探針

早期RT - qPCR使用的主要是TaqMan探針,它是一種長20nt左右的寡核苷酸序列,其5′ - 端連有一個熒光報(bào)告基團(tuán),3′ - 端有一個熒光淬滅基團(tuán),探針完整時(shí)報(bào)告基團(tuán)熒光被淬滅,不會產(chǎn)生信號。它通過堿基配對與產(chǎn)物結(jié)合,利用Taq聚合酶的外切酶活性,探針在擴(kuò)增過程中被切斷,報(bào)告基團(tuán)因與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離而產(chǎn)生熒光信號。特異性TaqMan探針為檢測提供了高特異性,但每種探針的設(shè)計(jì)和優(yōu)化大大提高了檢測成本。

基于TaqMan探針的缺點(diǎn),羅氏公司推出了UPL通用探針[38],長度僅為8 ～ 9個堿基,結(jié)合LNA技術(shù)合成。此類探針的最大優(yōu)勢即省去了為每種miRNA單獨(dú)設(shè)計(jì)探針的過程,特別是為定量多種miRNA節(jié)省大量時(shí)間。LNA是一種核酸修飾技術(shù),通過一個亞甲基橋?qū)⒑颂堑?′ - 位氧原子和4′ - 位碳原子連接起來(如圖4所示),增加了核酸的穩(wěn)定性,提高了熔點(diǎn)溫度。

圖4 LNA單體示意圖Fig. 4 LNA Monomer

這種探針雖然序列短,但由于LNA的加入而大幅度提高了熔點(diǎn)。通過配合莖環(huán)引物上特定序列使用,能保證很高的檢測特異性。Wu等人[39]使用UPL探針利用SLP - RT - qPCR法對植物中幾類miRNA檢測發(fā)現(xiàn),UPL探針表現(xiàn)了良好的特異性和靈敏度。Stratford等人[40]用該法定量siRNA時(shí),比較TaqMan探針和UPL探針的特異性發(fā)現(xiàn),定量過程中的特異性主要由莖環(huán)引物提供,兩者未表現(xiàn)出明顯區(qū)別。利用UPL探針檢測miR - 166,經(jīng)過45個循環(huán)反應(yīng),陰性對照未檢測到熒光信號[41]。

4. 2 SYBR Green I的應(yīng)用

SYBR Green I是一種非飽和的菁類熒光素,可以與DNA雙鏈的小溝非特異性結(jié)合,在游離狀態(tài)時(shí)幾乎無熒光信號,結(jié)合后熒光信號增強(qiáng)[42]。反應(yīng)體系中熒光信號強(qiáng)度代表了DNA雙鏈的數(shù)量。SYBR Green I具有通用性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)低毒的特點(diǎn),在miRNA以及DNA、mRNA等各種核酸物質(zhì)的定量中都有廣泛應(yīng)用。也正是由于其通用性強(qiáng)的特點(diǎn),因而可以與體系內(nèi)其他引物二聚體等雙鏈結(jié)合,使背景干擾增加,無法應(yīng)用于多重定量中。

事實(shí)上,應(yīng)用于miRNA定量的探針/染料的發(fā)展是隨著RT - qPCR的發(fā)展而同步進(jìn)行的,這種發(fā)展為SLP - RT - qPCR的發(fā)展注入了新的活力。UPL探針與SYBR Green I染色應(yīng)用,簡化了為每種miRNA單獨(dú)設(shè)計(jì)探針的過程,特別是UPL探針在多重定量中的應(yīng)用,降低了檢測的成本,且提供了相當(dāng)?shù)奶禺愋院挽`敏度,這對該方法的應(yīng)用推廣起到了促進(jìn)作用。

5 結(jié)語

基于莖環(huán)引物的RT - qPCR方法特異性好、靈敏度高、效率高,是一種定量miRNA的理想方法,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用與動物和植物miRNA的研究[30,43]。它簡化了實(shí)驗(yàn)的操作步驟,無需電泳、染色等后續(xù)操作。高通量檢測的發(fā)展,讓該方法應(yīng)用更加廣泛,在短時(shí)間內(nèi)即可完成對多種miRNA的定量。鑒于多種優(yōu)勢,該方法已經(jīng)推廣到siRNA等類似的小RNA定量中,對RNA干擾的相關(guān)研究起到了很大的推動作用[22]。但遺憾的是迄今還沒有任何一種定量方法可以對任意miRNA保證相同的檢測效率。隨著對miRNA研究的深入,一些恒溫檢測技術(shù)如RCA[44]、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增[45]、基于DNA酶切的信號擴(kuò)增[46]等相繼應(yīng)用到RNA檢測,相信更加穩(wěn)定高效的定量方法將會出現(xiàn)。

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