,,,,, ,,,,,,*, ,*

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,山東濟南 250353; 2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015; 3. 全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,北京 100015)

葡萄酒中的乙醇是酵母菌利用葡萄漿果中的糖進行發(fā)酵的主要產(chǎn)物,乙醇的含量通常為7% ～ 16% vol,一些自然甜型葡萄酒和加強葡萄酒的酒精含量可達到23%vol。黃酒是世界上最古老的酒類之一,與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒。黃酒中乙醇主要是酵母作糖化劑,利用稻米等原料產(chǎn)生的,黃酒中乙醇含量一般在10% ～ 20% vol。乙醇含量的測定是酒精飲料質(zhì)量控制的關(guān)鍵之一。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中測定葡萄酒和黃酒中乙醇的方法主要采用密度瓶法、酒精計法和氣相色譜法[1 - 4],常見的乙醇快速檢測方法主要有近紅外光譜法[5 - 6]、分光光度分析法[7]、催化動力學(xué)光度法[8 - 9]、熱值分析法[10]、分光光度酶法[11]等。密度瓶法和酒精計法需對樣品進行蒸餾,且操作過程繁瑣;而氣相色譜法存在成本較高、操作繁瑣、測定時間長等缺點;近紅外光譜法樣品無需前處理,測定速度快,但是建模難度大,定標(biāo)樣品的選擇、制備,精確的化學(xué)分析,基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及選擇計量學(xué)方法的合理性,都將直接影響最終的分析結(jié)果;光度法和熱值分析法準(zhǔn)確度較低。因此,有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的乙醇測量方法以滿足行業(yè)需求。

生物傳感器(Biosensor)是由具分子識別功能的生物材料、換能器和信號放大裝置構(gòu)成的分析工具。主要原理是利用酶等生物活性物質(zhì)作為傳感器的敏感元件,與待測物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),然后通過換能器將反應(yīng)轉(zhuǎn)換成可以輸出檢測的電信號,其大小與待測物的濃度成正比,通過分析信號從而實現(xiàn)對被測物的定量。生物傳感器分析具有操作簡單度快、特異性好、靈敏度高等特點,已應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸和葡萄糖[12 - 13]等的快速檢測。本文采用生物傳感器法對葡萄酒和黃酒中乙醇的檢測進行研究,建立適合于酒類企業(yè)對生產(chǎn)過程及產(chǎn)品質(zhì)量進行測定的快速檢測方法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

乙醇氧化酶(EC 1. 1. 3. 13,38units/mg) 購于美國sigma公司;核微孔膜(孔徑0. 2μm,直徑9mm) 美國Nucleopore公司;王朝干紅葡萄酒(酒精度14% vol);張裕干紅葡萄酒(酒精度15% vol);長城干白葡萄酒(酒精度12% vol);石庫門上海老黃酒(酒精度≥10%vol);古越龍山五年陳花雕酒(酒精度≥12% vol);戊二醛(40%)、無水乙醇 均為分析純;實驗用水 蒸餾水。

生物傳感分析儀(SBA40C型) 山東省科學(xué)院生物研究所;分析天平(AB - 204N) 梅特勒。

1. 2 檢測原理

主要原理是利用乙醇氧化酶作為傳感器的敏感元件,與樣品中的乙醇反應(yīng)生成H2O2,在過氧化氫電極產(chǎn)生電流,其大小與待測物的濃度成正比,從而實現(xiàn)對被測物的定量[14]。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 固定化乙醇氧化酶膜制備 將5μL乙醇氧化酶滴涂在核微孔基質(zhì)膜(直徑9mm)上形成6mm酶層圓斑,4℃下在戊二醛(40%)蒸汽中交聯(lián)反應(yīng)12h,制成乙醇氧化酶膜[15]。

1. 3. 2 乙醇生物傳感分析儀定標(biāo) 采用20μL/100mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液作為儀器定標(biāo)溶液,取25μL儀器定標(biāo)溶液進樣,當(dāng)前后兩次測定的響應(yīng)值的相對誤差小于1. 5%時,儀器自動定標(biāo)通過,并記錄相應(yīng)的響應(yīng)值。如定標(biāo)未通過,需要再連續(xù)采用定標(biāo)液進樣,直至定標(biāo)通過方可進行樣品的測定。

1. 3. 3 樣品測定 樣品用0. 1mmol/L,pH7. 2的磷酸緩沖液稀釋1000倍,使乙醇含量在傳感器的響應(yīng)線性范圍內(nèi),然后準(zhǔn)確吸取25μL稀釋后的酒樣注入反應(yīng)池中,記錄測量結(jié)果,根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)計算酒樣中乙醇含量。

1. 3. 4 線性范圍 將無水乙醇用磷酸緩沖液(0. 1mmol/L pH7. 2)配制濃度梯度為2、4、6、8、10、20、40、60、80μL/100mL的乙醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,取25μL配制的乙醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定,每個濃度重復(fù)進樣3次,以乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),測量結(jié)果為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定線性范圍。

1. 3. 5 pH對酶活的影響 分別采用pH=6. 0、6. 5、7. 0、7. 5和8. 0磷酸緩沖液作為酶膜的介質(zhì),以40μL/100mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液為測試液(乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與酶膜的介質(zhì)的pH保持一致),記錄乙醇酶膜活性相應(yīng)值,研究介質(zhì)pH對酶活的影響。

1. 3. 6 方法的加標(biāo)回收率 分別向稀釋1000倍后的酒樣中添加一定濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,進行加標(biāo)回收率實驗。

1. 3. 7 干擾實驗 黃酒和葡萄酒中其它共存化合物的最高濃度不超過80g/L[16 - 17],稀釋1000倍后不超過為80mg/L;而甲醇最高濃度不超過0. 1g/L[18 - 19],稀釋1000倍后最高為0. 1mg/L,為了考察酒中存在的其他物質(zhì)對傳感器的影響,實驗分別配制20μL/100mL的乙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸、β - 苯乙醇、抗壞血酸的各單組分溶液和0. 2μL/100mL甲醇溶液進行測定,以乙醇的響應(yīng)值為基準(zhǔn)值100%,記錄其它組分的相對響應(yīng)值。

1. 3. 8 乙醇氧化酶膜穩(wěn)定性研究 將乙醇氧化酶膜安裝在電極上,對該膜在室溫下的穩(wěn)定性進行了研究,每次進同一濃度的乙醇溶液,連續(xù)測量13d。

2 結(jié)果與討論

2. 1 線性范圍

由圖1可知,當(dāng)乙醇濃度為2 ～ 80μL/100mL時,乙醇濃度和測量值具有良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0. 9849x+0. 0202,相關(guān)系數(shù)R2=0. 9997。

圖1 乙醇生物傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of ethanol biosensor

2. 2 pH對酶活的影響

酶是一種蛋白質(zhì),介質(zhì)的pH會影響酶的活性,過酸或過堿的介質(zhì)會導(dǎo)致酶的活性下降,甚至失活。pH對乙醇傳感器酶活的影響實驗結(jié)果如圖2所示,pH在7. 0 ～ 7. 5時乙醇酶膜活性最高,與文獻報導(dǎo)一致[20 - 21],本實驗選擇pH7. 2的磷酸緩沖液作為乙醇傳感器介質(zhì)溶液和樣品稀釋液。

表1 生物傳感器測定葡萄酒和黃酒中乙醇的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Recovery test of alcohol in wine and rice wine by biosensor(n=3)

表2 生物傳感器測定葡萄酒和黃酒中乙醇含量的精密度測定結(jié)果(n=4)Table 2 Precision test of alcohol in wine and rice wine by biosensor(n=4)

圖2 pH對乙醇氧化酶活性的影響Fig. 2 The effect of pH on alcohol oxidase activity

2. 3 加標(biāo)回收率

如表1所示,乙醇加標(biāo)回收率在99. 22% ～101. 59%之間,表明該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確,可定量檢測葡萄酒和黃酒中乙醇含量,結(jié)果見表1。

2. 4 精密度、重復(fù)性測定

每個酒樣重復(fù)進樣4次,計算平均值,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,研究了傳感器的重復(fù)性和精密度,結(jié)果見表2。由表可知,傳感器的精密度和重復(fù)性較好,RSD值小于1%。

2. 5 干擾實驗

由表3可知其樣品中其它共存組分對乙醇的測量結(jié)果沒有影響,說明傳感器的抗干擾能力較好。

表4 乙醇傳感器和酒精計法對樣品的測定結(jié)果(n=6)Table 4 The determination results of samples by ethanol biosensor and alcohol meter method(n=6)

注:表中數(shù)值是已按稀釋比例換算成的實際乙醇濃度。

表3 乙醇傳感器的抗干擾性(n=3)Table 3 The anti - interference performance of ethanol biosensor(n=3)

2. 6 酶膜穩(wěn)定性研究

如圖3所示,酶電極在室溫下13d后酶電極的響應(yīng)值仍剩初始值的76%,并且對同一濃度的乙醇溶液連續(xù)測量6次,RSD值為4. 61%,說明乙醇氧化酶膜可在室溫下,13d內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性。

圖3 乙醇傳感器的穩(wěn)定性Fig. 3 The stability of ethanol biosensor

2. 7 乙醇傳感器法和酒精計法間的比較

利用乙醇傳感器法和國標(biāo)酒精計法分別對3種葡萄酒和2種黃酒進行分析,結(jié)果如表4所示,并對兩種方法測量的結(jié)果進行t - 檢驗,得到的p值大于0. 05,說明兩種方法測量結(jié)果無顯著性差異。

3 結(jié)論

本文建立了乙醇生物傳感器法測定葡萄酒和黃酒中乙醇含量的方法,該方法的線性范圍為2 ～80μL/100mL,精密度和重復(fù)性RSD小于1. 0%,加標(biāo)回收率在99. 22% ～ 101. 59%之間,且具有很好的抗干擾能力,與酒精計法測定結(jié)果相關(guān)性良好,用t - 檢驗分析,無顯著性差異。本方法的建立為酒類企業(yè)的產(chǎn)品快速檢驗或酒類生產(chǎn)過程質(zhì)量控制提供有效的途徑。

[1]GB/T 15038 - 2006. 葡萄酒、果酒通用分析方法[S].

[2]GB/T 13662 - 2008. 黃酒[S].

[3]Xu Rong,Gong Qian. The application of optical fiber sensing technology in multiphase flow parameter measurement[J]. Journal of Engg College of Armed Police Force,2000,16(6):21 - 24.

[4]謝文,丁慧瑛,章曉氡. 葡萄酒、果酒中乙醇含量的測定方法[J]. 色譜,2004,22(5):561.

[5]李燕萍,錢瑩,段綱. 采用近紅外光譜測定木薯乙醇發(fā)酵液中乙醇、甘油和葡萄糖含量[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2009,135(18):117 - 121.

[6]楊維旭,孔令新,操野,等. 近紅外光譜在酒精發(fā)酵過程檢測中的應(yīng)用[J]. 釀酒科技,2011(9):84 - 88.

[7]Pilong G J. Determination of ethanol in wine by titrimetric and spectrophotometric dichromate methods - collabotative study[J]. J Assoc Off Anal Chem,1985,68(2):188 - 190.

[8]陳玉靜,徐慧. 催化動力學(xué)光度法間接測定啤酒中乙醇[J]. 理化檢驗,2013,49:113 - 114.

[9]朱昌青,周宏標(biāo),李永新,等. 催化動力學(xué)光度法測定啤酒中的乙醇[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報,2000,23(2):147 - 148.

[10]栗智,車云霞,高學(xué)平,等. 用熱值分析法測定飲用酒的酒精度[J]. 中國釀造,2006(9):68 - 70.

[11]Vidigal S,Rangel Aoss. Sequential injection LOV format for peak height and kinetic measurement modes in the spectrophotometric enzymatic determination of ethanol:Application to different alcoholic beverages[J]. Talanta,2008,77(2):

494 - 499.

[12]A M Herrero,T Requena,A J Reviejo,etal. Determination of L - lactic acid in yoghurt by a bienzyme amperometric graphite -Teflon composite biosensor[J]. Eur Food Res Technol,2004,219:556 - 559.

[13]張彥,南彩鳳,馮麗,等. 殼聚糖固定化葡萄糖氧化酶生物傳感器測定葡萄糖的含量[J]. 分析化學(xué),2009,37(7):1049 - 1052.

[14]A Morales,F Céspedes,E Martínez - Fàbregas,etal. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase - graphite -polymer biocomposite[J]. Electrochimica Acta,1998,43(23):3575 - 3579.

[15]T B Goriushkina,A P Soldatkin,S V Dzyadevych. Application of amperometric biosensors for analysis of ethanol,glucose,and lactate in wine[J]. Journal of Agricultural and Food chemistry,2009,57(15)：6528 - 6535.

[16]雷安亮,鐘其頂,高紅波,等. 靜態(tài)頂空 - 氣相色譜法測定葡萄酒中主要香氣成分研究[J]. 中國釀造,2009(5):147 - 151.

[17]于海燕,張妮,朱建才. 氣相色譜 - 質(zhì)譜結(jié)合吸附萃取法測定陳釀黃酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)[J]. 食品科學(xué),2011,22(32):179 - 183.

[18]葉建晨,楊佳佩. 頂空毛細管氣相色譜法測定葡萄酒中甲醇殘留量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2011,21(6):1359 - 1360.

[19]殷德榮. 毛細管氣相色譜法測定紹興黃酒中揮發(fā)性物質(zhì)[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(8):1930 - 1931.

[20]G J Lubrano,M H Faridnia,G Palleschi,etal. Amperometric alcohol electrode with extended linearity and reduced interferences[J]. Analytical Biochemistry,1991,198：97 - 103.

[21]Guangming Wen,Yan Zhang,Shaomin Shuang,etal. Application of a biosensor for monitoring of ethanol[J]. Biosensors and Bioelectronics,2007,23:121 - 129.