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(湖南人文科技學(xué)院,湖南婁底 417000)

玉竹(Polygonatumodoratum(Mill. )Druce)為百合科黃精屬的多年生草本植物,其干燥根莖又名尾參、玉參,是藥食兩用的植物資源,中醫(yī)常做補陰藥,臨床常用于治熱病傷陰、咳嗽煩渴、虛勞發(fā)熱、消谷易饑、小便頻數(shù)等癥[1]。我國玉竹資源豐富,栽培歷史悠久,不同生長地域的玉竹的活性物質(zhì)和微量元素含量有很大的差別,其中湖南湘玉竹品質(zhì)較佳。隨著對玉竹研究的不斷深入,人們已從該植物中分離純化出多糖、甾體皂苷,黃烷酮類、揮發(fā)油、強心苷、生物堿等多種活性成分[2],但對玉竹多酚的相關(guān)研究尚很少報道?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),玉竹提取物除了具有明顯的降血糖、提高免疫功能、抗腫瘤作用外,還具有抗衰老、治療白癜風(fēng)等作用[3 - 5]。近年來,人們還利用其功能活性開發(fā)了玉竹茶、玉竹汁、玉竹復(fù)合飲料等保健食品及玉竹中藥化妝品等相關(guān)產(chǎn)品,其綜合利用經(jīng)濟價值逐漸引起人們的重視。

表1 各單因素實驗水平設(shè)計Table 1 Single variable test design

微波技術(shù)具有加速細胞破解、加快內(nèi)部活性物質(zhì)溶出等優(yōu)點,作為現(xiàn)代植物有效成分提取的新方法,已廣泛用于多種天然物質(zhì)的萃取[6 - 8]。本文采用微波輔助提取(MAE)玉竹多酚,利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化玉竹多酚的提取工藝,并研究玉竹多酚的體外抗氧化活性,為建立合理的玉竹多酚制備方式提供技術(shù)支持,為玉竹多酚的深入研究提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù),對綜合開發(fā)、利用玉竹資源有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

玉竹 由湖南省邵東縣玉竹生產(chǎn)基地提供,經(jīng)湖南省婁底市科研所劉澤發(fā)副研究員鑒定為百合科植物玉竹。其根莖經(jīng)45℃烘干,粉碎,過60目篩,0 ～ 4℃保存?zhèn)溆?二苯基苦味酰基苯(DPPH)、鄰苯三酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林 - 酚試劑(FC) 購于Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

微波萃取儀 奧地利安東帕公司(Multiwave 3000)16SOLVMF100轉(zhuǎn)子,配備磁力攪拌裝置;UV - 1240紫外分光光度計 日本島津;冷凍離心機 美國熱電。

1.2福林酚法測定玉竹多酚含量

測定多酚含量的方法參考文獻[9 - 10],并略作修改,稱取玉竹粉1g,加入乙醇溶液,在一定的微波功率下提取一定時間,真空抽濾,濾液經(jīng)3500r/min離心分離5min,取上清液定容至50mL容量瓶。準(zhǔn)確移取樣品液5. 0mL于50mL容量瓶中,加入FC試劑1. 0mL充分混合后靜置1min,加入10mL 7%的碳酸鈉溶液,充分混合后用蒸餾水定容,置30℃恒溫水浴中反應(yīng)1h,不斷振蕩。在波長765nm處測定吸光度值(以蒸餾水為空白對照)。

樣品中多酚物質(zhì)含量(以沒食子酸計,mg/g)

GAE=X×V1×V2/W

式中,X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品濃度值(mg/mL);V1為樣品液稀釋倍數(shù);V2為樣品液總體積(mL);W為原料重量(g)。

1.3單因素實驗

稱取玉竹粉1g,放置于250mL錐形瓶中,加入一定量的乙醇溶液,用保鮮膜封口,避光放置潤濕20min,使溶液充分滲入細胞組織內(nèi),經(jīng)微波輻射后真空抽濾,濾液經(jīng)3500r/min離心分離5min后定容到50mL容量瓶中作為玉竹多酚提取樣液,測定多酚含量。用微波功率240W、微波萃取儀爬坡時間(微波功率從0W上升到設(shè)定功率的時間)10min、保持時間(提取時間)25min、料液比1∶ 30(g/mL),乙醇濃度50%,作為單因素篩選實驗的基礎(chǔ)條件。研究微波功率、保持時間、料液比、乙醇濃度中的某一因素時,其他條件保持不變,單因素實驗設(shè)計見表1。

1.4微波輔助提取(MAE)玉竹多酚的工藝優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上,綜合考慮各因素對玉竹中多酚物質(zhì)得率的影響,采用統(tǒng)計分析軟件Design -Expert7. 0建立4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗[11 - 12],通過實驗確定最優(yōu)提取工藝,以玉竹多酚得率作為響應(yīng)值,選擇微波功率、提取時間、料液比、乙醇體積分數(shù)為自變量,變量編碼值根據(jù)下列方程確定:

χi=(Xi-X0)/Xi

式中:χi- 自變量代碼值;Xi- 自變量真實值;X0- 在實驗中心點自變量的真實值;Xi- 自變量的變化步長。自變量X1(微波功率,W),自變量X2(輻射時間,S),自變量X3(料液比),自變量X4(乙醇體積分數(shù),%),4個自變量因素編碼及水平見表2。

表2 自變量因素編碼及水平Table 2 Independent variable coding and level

注:對真實值的特征編碼:χ1=(X1- 300)/60;χ2=(X2- 25)/5;χ3=(X3- 30)/10;χ4=(X4- 50)/10。

1.5體外抗氧化性能測定

1. 5. 1 對DPPH自由基清除能力的測定 參考Luo等[13]的方法,同時作適當(dāng)修改,取玉竹多酚和維生素C母液分別稀釋成0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、2. 0、3. 0、3. 5μg/mL的溶液,吸取不同濃度的玉竹多酚和維生素C溶液2mL,加入2mLDPPH·溶液(0. 2mmol/L)搖勻,避光放置30min,以無水乙醇調(diào)零,測定517nm波長處的吸光度(Ai);分別測定2mL不同濃度的玉竹多酚和維生素C溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光度作為對照(Ac);測定2mL蒸餾水溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光度作為空白(A空白),計算清除率。

清除率(%)=[(Ac-Ai)/Ac]×100

1. 5. 2 對超氧陰離子清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法,參考李興飛等[14]實驗方法并略作修改。具體方法如下:將處理得到的玉竹多酚樣品用無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5mg/mL的溶液。取上述各溶液1mL置于10mL試管中,依次加入3. 8mL蒸餾水,5. 0mL 0. 05mol/L Tris - HCl(ph8. 3),0. 2mL 2mmol/L鄰苯三酚,迅速混勻,測定A322,每隔1min測定1次,直到反應(yīng)后第5min,求斜率V。以蒸餾水作空白調(diào)零;以維生素C作實驗對照,求得清除率K1

計算公式如下:

清除率K1(%)=(Vs-V)/Vs×100

式中:Vs- 1mL蒸餾水與反應(yīng)體系反應(yīng)的速率;V- 1mL樣品液與反應(yīng)體系反應(yīng)的速率。

2 結(jié)果與討論

2.1單因素實驗及結(jié)果

2. 1. 1 微波功率對多酚含量的影響 如圖1a所示,當(dāng)功率300W時多酚含量最高,而當(dāng)大于功率300W時,多酚含量降低,在一定時間內(nèi),微波功率越高,體系升溫越快,固液擴散速度也越快,有利于物料中有效成分的浸出。然而,當(dāng)微波功率過大時,多酚易發(fā)生氧化和降解[7]。

2. 1. 2 微波輻射時間對多酚含量的影響 從圖1b可以看出,當(dāng)微波輻射提取時間為25min時,多酚含量最高;當(dāng)輻射時間大于25min時,隨著時間的延長,多酚含量開始下降,這可能是因為提取溶劑溫度的不斷升高以及高溫提取時間的延長,導(dǎo)致多酚類物質(zhì)降解,從而使多酚含量下降。另外,時間越長,耗能越大,所以最佳微波輻射時間為25min。

2. 1. 3 料液比對多酚含量的影響 圖1c表明,隨著料液比的增大,多酚含量逐漸升高,當(dāng)料液比為1∶ 30(g·mL-1)時,多酚含量到達最大值,之后繼續(xù)增大料液比,多酚含量略有下降并趨于平緩,溶劑用量多少,關(guān)系生產(chǎn)成本,并為后續(xù)的濃縮操作帶來較大的工作量。因此,最佳料液比1∶ 30(g·mL-1)。

2. 1. 4 乙醇體積分數(shù)對多酚含量的影響 如圖1d所示,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,多酚得率呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)乙醇體積分數(shù)50%時多酚得率最高,因此,最佳乙醇體積分數(shù)為50%。

圖1 玉竹多酚提取單因素實驗結(jié)果Fig. 1 Single variable test of polyphenols extraction from Polygonatum odoratum

2.2微波提取實驗?zāi)Ｐ徒⑴c顯著性檢驗

2. 2. 1 模型建立與顯著性檢驗 設(shè)計并優(yōu)化的29組實驗安排及實驗結(jié)果見表3。運用對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得響應(yīng)值——多酚含量(Y)與4個因素二次多項式回歸模型:

Y= - 376. 01+0. 71X1+12. 61X2+2. 15X3+5. 41X4+0. 0053X1X2+0. 0027X1X3- 0. 0015X1X4+0. 0035X2X3- 0. 06X2X4- 0. 004X3X4- 0. 0013X12- 0. 22X22- 0. 044X32- 0. 034X42

由表4回歸模型的方差分析可知,模型p=0. 0015,表明模型極其顯著;F回歸=5. 50>F0.01(14,14)=3. 70,p=0. 0015,表明二次多元回歸模型極其顯著;F失擬=3. 290. 05,失擬項不顯著,該方程對實驗擬合較好,可以對不同條件下的玉竹多酚提取率進行預(yù)測;模型的決定系數(shù)R2=0. 8461,說明用該模型可以解釋84. 61%響應(yīng)值的變化。

由表5中模型系數(shù)的顯著性檢驗數(shù)據(jù)可知,一次項X1和二次項X12、X22、X32、X42對多酚含量的影響達極顯著水平,一次項X3和交互項X2X4對多酚含量的影響均達顯著水平,由F值可知4個因素對玉竹多酚含量的影響依次為:X1(微波功率)>X3(料液比)>X2(提取時間)>X4(乙醇體積分數(shù))。

表3 Box - Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box - Behnken design and data of the investigated responses of extracts

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

為進一步確定最佳點的數(shù)值,對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù),并令其等于零,代入編碼公式得多酚提取的最佳工藝:X1(微波功率)=329. 17W,X2(輻射時間)=26. 12min,X3(料液比)=1∶ 33. 86,X4(乙醇體積分數(shù))=49. 03%。

2. 2. 2 模型驗證 結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果,微波輔助提取玉竹多酚的最佳工藝參數(shù)為:微波功率329. 17W,提取時間26. 12min,料液比1∶ 33. 86,乙醇體積分數(shù)49. 03%。在此條件下玉竹多酚理論提取含量為67. 52mg/g,為考慮實際生產(chǎn)工藝,將工藝參數(shù)調(diào)整為微波功率329W,提取時間26min,料液比1∶ 34,乙醇體積分數(shù)49%,在此條件下,玉竹多酚提取含量為67. 40mg/g,兩者非常接近,說明該模型可靠。

表5 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 5 Significance test of coefficients of regression model

注:* *表示p<0. 01,極顯著;*表示p<0. 05,顯著。

通過多酚含量回歸方程所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖,見圖2 ～ 圖7。各圖顯示微波功率、微波輻射時間、乙醇體積分數(shù)和料液比中任意兩個變量取零水平時,其余2個變量對玉竹多酚含量的影響。

圖2 微波功率和輻射時間對多酚含量的影響Fig. 2 Effect of microwave power and microwave time on polyphenols yield

曲面圖的形狀可反應(yīng)出單因素對多酚含量的影響,曲面越陡峭,影響越顯著。從圖2 ～ 圖7的對比中可以得出各因素對玉竹多酚含量影響大小依次是微波功率>液料比>微波輻射時間>乙醇體積分數(shù),與方差分析結(jié)果一致(F值大小反映了各因素對玉竹多酚含量的影響)。

擬合的響應(yīng)面和等高線圖比較直觀地反映了各因素間的交互作用。根據(jù)圖中等高線的形狀(圓形或橢圓形),可以看出相應(yīng)兩個變量之間的交互作用是否顯著。圓形的等高線表明交換作用較小,可以忽略;而橢圓的等高線則表明交換作用較為顯著或極其顯著。圖6中等高線為橢圓形,說明X2X4交互作用顯著;圖2 ～ 圖5、圖7的等高線呈圓形,說明X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X3X4的交互作用不顯著,與方差分析的結(jié)果相一致。從響應(yīng)面和等高線圖可以看出,在所選范圍內(nèi)存在極值,即響應(yīng)面最高點,同時也是等高線最小橢圓的中心點。

圖3 微波功率和料液比對多酚含量的影響Fig. 3 Effect of microwave power and ratio of solvents to raw material on polyphenols yield

圖5 微波輻射時間和料液比對多酚含量的影響Fig. 5 Effect of microwave time and ratio of solvents to raw material on polyphenols yield

圖6 微波輻射時間和乙醇體積分數(shù)對多酚含量的影響Fig. 6 Effect of microwave time and ethanol concentration on polyphenols yield

圖7 料液比和乙醇體積分數(shù)對多酚含量的影響Fig. 7 Effect of ratio of solvents to raw material and ethanol concentration on polyphenols yield

2.3玉竹多酚抗氧化性能

2. 3. 1 玉竹多酚對DPPH自由基清除能力 由圖8可以看出,在質(zhì)量濃度0. 25 ～ 0. 75μg/mL范圍,玉竹多酚對DPPH·的清除率低于VC,在質(zhì)量濃度1. 0μg/mL以上時,玉竹多酚的清除率與VC清除率相當(dāng),在質(zhì)量濃度3. 5μg/mL時,玉竹多酚的清除率達到87%,說明玉竹多酚對DPPH·具有明顯的清除能力,并且呈明顯的劑量依賴性關(guān)系。

圖8 玉竹多酚對DPPH自由基清除率Fig. 8 DPPH radical scavenging rate of Polygonatum odoratum polyphenols

圖9 玉竹多酚對超氧陰離子的清除率Fig. 9 Superoxide anion scavenging rate of Polygonatum odoratum polyphenols

2. 3. 2 玉竹多酚對超氧陰離子清除能力 如圖9所示,玉竹多酚對超氧陰離子具有一定的清除率,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達到1. 5mg/mL時,玉竹多酚的清除率為87. 23%,略低于VC的清除率(92. 87%),同時玉竹多酚的清除能力在此濃度下幾乎達到飽和。雖然玉竹多酚對超氧陰離子的清除率略低于同濃度的VC,其較高的清除能力使玉竹可作為潛在的天然抗氧化物質(zhì)來源。

3 結(jié)論

3.1影響玉竹多酚微波輔助提取的主次因素順序為微波功率>料液比>輻射時間>乙醇體積分數(shù)。

3.2通過對二次回歸模型優(yōu)化得到微波輔助提取玉竹多酚的最優(yōu)工藝為微波功率329W,提取時間26min,料液比1∶ 34(g/mL),乙醇體積分數(shù)49%,在此條件下所得的玉竹多酚含量為67. 40mg/g,因此該模型可以很好的預(yù)測玉竹多酚提取得率。

3.3體外抗氧化實驗研究表明,玉竹多酚對DPPH·具有明顯的清除能力,并且呈明顯的量效關(guān)系。玉竹多酚對DPPH·的清除率與VC清除率相當(dāng),當(dāng)質(zhì)量濃度為3. 5μg/mL時,玉竹多酚和VC對DPPH·的最大清除率分別達87. 01%、88. 78%;玉竹多酚對超氧陰離子的清除能力略低于同濃度的VC,但仍具有較高的清除能力,當(dāng)質(zhì)量濃度為1. 5mg/mL時,玉竹多酚和VC對超氧陰離子的最大清除率分別達89. 32%、94. 21%。

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