張淑玲，周縝，寧馳，祝漢忠，鄒曉

(1 青島市(中心)腫瘤醫(yī)院，山東 青島 266042； 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心)

骨組織形成過程中，激素調(diào)節(jié)與生長因子調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)共同形成了神經(jīng)-內(nèi)分泌-局部生長因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與骨組織形成的整個(gè)過程[1]。生長激素(GH)是由垂體分泌的多肽，是膠原生長的一種主要調(diào)節(jié)劑[2]。下丘腦GH-胰島素樣生長因子-1(GH-IGF-1)系統(tǒng)是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)人體代謝的內(nèi)分泌軸，不僅對人體的生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用，對成年后人體組織的修復(fù)重建亦有一定的調(diào)控作用[3]。研究結(jié)果表明，任何對下丘腦GH-IGF-1系統(tǒng)產(chǎn)生影響的因素均可影響人體的生長發(fā)育與修復(fù)重建過程[4]。動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，壯筋續(xù)骨湯能夠促進(jìn)骨折愈合[5-6]，但其機(jī)制尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)試圖觀察壯筋續(xù)骨湯對大鼠股骨骨折后血清GH和IGF-1水平影響，探討其促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 動物分組

成年健康雄性Wistar大鼠72只，清潔級，體質(zhì)量230～250 g，由青島市藥物檢驗(yàn)所動物中心提供，合格證號：SCXK(魯)20120010。將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和治療組各24只。

1.2 模型制備

各組均應(yīng)用100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉動物，俯臥位固定，常規(guī)消毒，無菌操作，行外側(cè)切口，經(jīng)股前、外側(cè)肌間隔分離至股骨。模型組和治療組大鼠用低速牙科鉆在股骨中段切斷股骨，然后行克氏針(直徑1 mm，上海醫(yī)用縫合針廠)髓腔逆行固定，逐層縫合，無菌包扎，手術(shù)成功率100%[7]。對照組不切斷股骨，其余步驟同上。動物術(shù)后常規(guī)籠養(yǎng)，自由活動與進(jìn)食。

1.3 治療方法

根據(jù)清代趙濂《傷科大成》配方，由青島大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》(國中醫(yī)藥發(fā)[2009]3號)制備壯筋續(xù)骨湯。每副中藥充分煎煮兩次，得藥液224 mL，內(nèi)含生藥112 g，濃度5.0 g/L。根據(jù)王祥杰等[8]報(bào)道的劑量1.25 g/kg (2.5 mL/kg)，治療組每日灌胃1次，連續(xù)28 d。對照組和模型組同步給予等量的生理鹽水。

1.4 評價(jià)指標(biāo)和方法

1.4.1大體觀察 治療后7、14、21、28 d，每組各取6只動物，水合氯醛麻醉，完整取出股骨，剔除多余軟組織，生理鹽水洗滌，觀察記錄骨折愈合情況。然后置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h，蒸餾水浸泡4 h，再置于200 g/L乙二胺四乙酸溶液中脫鈣15 d。常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿股骨縱軸連續(xù)切片，厚度5 μm，貼于載玻片上。蘇木精-伊紅染色，觀察骨痂組織結(jié)構(gòu)。

1.4.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，然后以100 g/L的水合氯醛溶液(300 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈取血4 mL，4 000 r/min離心10 min，分離血清，采用雙抗夾心ELISA試劑盒(BG公司)測定血清GH和IGF-1水平。測定前室溫復(fù)融，再次離心取上清液標(biāo)本100 μL，用酶標(biāo)儀(Bio-Rad 550型，美國)在450 nm波長處測定GH和IGF-1的吸光度值，根據(jù)樣品的吸光度值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的GH和IGF-1的濃度，單位以“ng/L”表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大體解剖觀察

對照組大鼠骨皮質(zhì)完整，模型組骨折7 d骨折斷端主要為纖維性肉芽組織，至14 d形成纖維性骨痂，21 d纖維性骨痂增多并出現(xiàn)軟骨骨痂，28 d形成軟骨-骨性骨痂。治療組大鼠術(shù)后7～21 d骨痂結(jié)構(gòu)與模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較無明顯差異，但至術(shù)后28 d骨痂硬度較模型組明顯增大。

2.2 組織病理觀察

對照組大鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠術(shù)后骨折端斷為血腫組織所填充，骨折后7 d形成肉芽組織，14 d骨折端形成大量纖維性骨痂，21 d有散在骨小梁形成，28 d骨小梁清晰可見。治療組骨痂結(jié)構(gòu)在7～21 d與模型組相應(yīng)時(shí)間比較無顯著性差異，但至28 d顯著優(yōu)于骨折組。

2.3 血清GH水平

大鼠血清GH水平在對照組術(shù)后7～28 d未見顯著性變化(F=3.18，q=0.46～1.76，P>0.05)，在模型組和治療組術(shù)后的7～21 d也未見顯著性變化(F=2.73，q=0.32～2.11，P>0.05)，但28 d較21 d顯著下降(t=10.46，P<0.05)。組間比較表明，大鼠血清GH水平在模型組和治療組術(shù)后7～28 d各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照組(F=13.64，q=2.15～12.31，P<0.05)；治療組術(shù)后7～21 d與模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異無顯著意義(F=1.16，q=0.24～1.78，P>0.05)，但28 d仍顯著高于模型組(t=6.48，P<0.05)和對照組(t=12.82，P<0.05)。見表1。

表1 各組治療后血清GH水平

2.4 血清IGF-1水平

大鼠血清IGF-1水平在對照組術(shù)后7～28 d未見顯著性變化(F=1.31，q=0.17～2.06，P>0.05)，模型組和治療組術(shù)后7～21 d無顯著性變化(F=2.15，q=0.62～1.83，P>0.05)，至28 d較21 d則顯著下降(t=6.11，P<0.05)。組間比較則表明，大鼠血清IGF-1水平在模型組和治療組術(shù)后7～28 d各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照組(F=21.42，q=3.01～16.19，P<0.05)；治療組術(shù)后7～21 d與模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異無顯著意義(F=1.92，q=0.49～

1.34，P>0.05)，但28 d則顯著高于模型組(t=5.94，P<0.05)和對照組(t=7.51，P<0.05)。見表2。

表2 各組治療后血清IGF-1水平

3 討 論

骨的更新或再建包括破骨細(xì)胞吸收骨和成骨細(xì)胞生成骨兩個(gè)過程，即骨骼不斷攝取血漿中的鈣以供骨的生長，同時(shí)骨骼又不斷地被吸收，將骨鈣釋放入血。骨折后某些骨生長因子能促進(jìn)新骨形成，縮短骨折愈合時(shí)間[9]。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，外源性生長激素對骨折愈合有促進(jìn)作用，且愈合時(shí)間平均提前1周[10]。但是外源性細(xì)胞因子半衰期短， 被清除率高，非注射給藥生物利用度低，不能持續(xù)有效地促進(jìn)骨折愈合，使其臨床應(yīng)用范圍受到限制。研究表明，中藥有效成分可促進(jìn)生長激素的分泌[11]，而生長激素是調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的主要激素，它把成骨活動中鈣磷代謝協(xié)調(diào)起來共同調(diào)節(jié)成骨作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞的有絲分裂，加速成骨細(xì)胞分化。GH對骨的主要作用機(jī)制如下。①刺激成纖維細(xì)胞IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ的形成。其中IGF-Ⅰ又被稱為骨生長因子，具有促進(jìn)骨細(xì)胞的有絲分裂，抑制破骨細(xì)胞的形成與成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞加速凋亡等作用[12]，從而促進(jìn)骨折愈合。②促進(jìn)軟骨生長板細(xì)胞分化和生長。③改善腸鈣吸收，興奮腎臟羥化酶活性，促進(jìn)骨鹽形成[13]。④促進(jìn)硫酸軟骨素和膠原合成，加速軟骨的鈣化進(jìn)程[14]，有效增加皮質(zhì)骨量，改善骨的整體力學(xué)性能[15]。骨折后垂體嗜酸性細(xì)胞GH表達(dá)增強(qiáng)，血清GH水平在24 h內(nèi)顯著升高，從而影響成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨鈣素合成，促進(jìn)糖異生、抑制糖降解，進(jìn)而提高血糖水平以代償創(chuàng)傷對人體造成的急性損壞[16]。此外，IGF-1可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞合成膠原Ⅰ，有利于成骨細(xì)胞改樣沉積和骨小梁的形成，有利于骨折的愈合和骨的改建和重塑。

中藥治療骨折除解痙止痛、活血化瘀、去腐生肌等常規(guī)作用外，是否也直接或間接影響骨生長因子的分泌、降解和活性調(diào)節(jié)，目前尚無完整的理論支持。壯筋續(xù)骨湯出自清代趙濂編纂的《傷科大成》。其中，當(dāng)歸、川芎合用祛瘀行滯活血，熟地益精填髓，

黃芪補(bǔ)氣益氣，三七具散瘀止血、消腫止痛，續(xù)斷補(bǔ)肝腎壯骨，杜仲補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，骨碎補(bǔ)腎強(qiáng)骨，紅花活血通經(jīng)，去瘀止痛；白芍補(bǔ)血止痛。從壯筋續(xù)骨湯的組方綜合分析，有活血化瘀、接骨續(xù)筋等功效，符合 “瘀去、新生、骨合” 的中醫(yī)治則。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，壯筋續(xù)骨湯在骨折術(shù)后第1～3周內(nèi)并沒有提高大鼠血清GH和IGF-1的水平，只是在21 d后繼續(xù)維持血清GH和IGF-1較高水平，說明壯筋續(xù)骨湯不是通過促進(jìn)GH和IGF-1分泌，而只是起到減緩其降解速率、增強(qiáng)其活性，從而促進(jìn)骨折愈合。

影響骨折愈合的因素較多，壯筋續(xù)骨湯的有效成分又極為復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)僅檢測了GH和IGF-1兩項(xiàng)指標(biāo)，難以全面反映壯筋續(xù)骨湯的療效和機(jī)制。今后需要提取壯筋續(xù)骨湯的有效成分，從細(xì)胞因子、有關(guān)激素、膠原合成、鈣磷代謝等方面深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ANDREASSEN T T, OXLUND H. Local anabolic effects of growth hormone on intact bone and healing fractures in rats[J]. Calcif Tissue Int, 2003,73(3):258-264.

[2] RASCHKE M, RASMUSSEN M H, GOVENDER S, et al. Effects of growth hormone in patients with tibial fracture: a randomised, double-blind, placebo-controlled clinical trial[J]. Eur J Endocrinol, 2007,156(3):341-351.

[3] OREFFO R O. Growth factors for skeletal Reconstruction and fracture repair[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2004,5(4):419-423.

[4] 郁衛(wèi)東,秦書儉. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在骨形成過程中的作用機(jī)制[J]. 中國臨床解剖學(xué)雜志, 2000,18(1):82-83.

[5] 王祥杰,周縝,潘月興,等. 壯筋續(xù)骨湯促進(jìn)骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 臨床醫(yī)學(xué)工程, 2012,19(1):26-27,31.

[6] 黃佩軍. 壯筋續(xù)骨湯聯(lián)合鎖定加壓鋼板內(nèi)固定治療脛骨平臺骨折療效觀察[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2012,31(14):20-21.

[7] 王祥杰,周縝,王貫習(xí),等. 壯筋續(xù)骨湯對骨折大鼠血清BMP和NPY水平的影響[J]. 臨床醫(yī)學(xué)工程, 2012,19(2):188-189,192.

[8] 王祥杰,潘月興,杜志仙,等. 壯筋續(xù)骨湯對大鼠骨折骨痂中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7和神經(jīng)肽Y表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2013,28(8):2420-2422.

[9] TURHANI D, WEISSENBOCK M, STEIN E, et al. Exogenous recombinant human BMP-2 has little initial effects on human osteoblastic cells cultured on collagen type I coated/noncoated hydroxyapatite ceramic granules[J]. J Maxillofac Surg, 2007,65(3):485-493.

[10] 王一民,裴國獻(xiàn),王鋼. 重組人生長激素對兔橈骨小段缺損的治療作用[J]. 美國中華創(chuàng)傷雜志, 2001,4(3):36-38.

[11] 王軍躍,成扶真,庹元斌,等. 接骨七厘片對實(shí)驗(yàn)性骨折愈合的影響[J]. 中國中醫(yī)骨傷科, 1997,5(2):3-5,67.

[12] VESTERGAARD P, MOSEKILDE L.Fracture risk is decreased in acromegaly——a potential beneficial effect of growth hormone[J]. Osteoporos Int, 2004,15(2):155-159.

[13] 柳海峰,陳晉杰,楊佩蓀,等. 三花接骨散促進(jìn)生長激素和骨折愈合的研究[J]. 中國中醫(yī)骨傷科, 1998,6(2):9-13.

[14] 陳晉杰,潘少川,張連柱,等. “三花接骨散”治療骨折的試驗(yàn)性報(bào)告[J]. 北京醫(yī)學(xué), 1995,1(1):58-61.

[15] 黃遂柱,戴克戎,湯亭亭,等. 重組人生長激素對摘除卵巢大鼠皮質(zhì)骨的影響[J]. 中華外科雜志, 2000,38(1):46-49.

[16] HEDSTROM M, SAAF M, BROSJO E, et al. Positive effects of short-term growth hormone treatment on lean body mass and BMC after a hip fracture: a double-blind placebo-controlled pilot study in 20 patients[J]. Acta Orthop Scand, 2004,75(4):394-401.