鄭志強(qiáng)，唐懷好，張文峰，王勇杰

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)胸外科，山東 青島 266033； 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科)

目前，臨床上對于Ⅱ～ⅢA期的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病人，在根治性切除術(shù)后接受鉑類聯(lián)合第三代抗腫瘤新藥的輔助化療已成為標(biāo)準(zhǔn)治療模式。但是，NSCLC完全切除術(shù)后輔助化療的療效欠佳，其術(shù)后5年生存率及無疾病生存率分別僅提高了4.1%和5.1%，主要是由于化療藥物的毒副作用及耐藥性所致。因此，研究耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，對提高化療療效和生存期具有重要意義。已有研究結(jié)果表明，3型β微管蛋白(TUBB3)與抗微管化療藥物關(guān)系最為密切。但是，目前TUBB3表達(dá)水平與NSCLC病人術(shù)后輔助化療療效的關(guān)系尚無定論，國內(nèi)外研究結(jié)論不一[1]。為此，我們研究了88例行長春瑞濱+順鉑(NP)方案輔助化療的NSCLC病人術(shù)后標(biāo)本，檢測腫瘤組織中TUBB3 mRNA表達(dá)水平，分析其與NSCLC病人臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC病人個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2006年1月—2009年12月，于我院接受根治性手術(shù)治療的Ⅱ～ⅢA期NSCLC病人88例，所有病人臨床病理和隨訪資料完整。其中男57例，女31例；年齡≤65歲47例，>65歲41例，中位年齡62歲；鱗狀細(xì)胞癌48例，腺癌36例，其他4例(腺鱗癌3例，大細(xì)胞癌1例)；高分化26例，中分化33例，低分化29例；按2009年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，ⅡA期24例，ⅡB期31例，ⅢA期33例。本組病人治療期間無死亡及嚴(yán)重并發(fā)癥，術(shù)前未行放化療，術(shù)后均行NP方案輔助化療4周期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人及家屬均簽訂知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

石蠟RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購自德國Qiagen公司，SYBR Green購自日本TaKaRa公司，MX 3000P型PCR儀購自美國STRATAGENE公司，所有引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1引物合成與設(shè)計 根據(jù)GenBank中TUBB3的cDNA序列設(shè)計引物如下。TUBB3:Forward 5′-CAGCAAGGTGCGTGAGGA-3′，Reverse 5′-AGC-CGGGCATGAAGAAGT-3′，擴(kuò)增片段長度353 bp；β-actin：Forward 5′-CTGGGACGACATAGGAGAA-AA-3′，Reverse 5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，擴(kuò)增片段長度564 bp。

1.3.2熒光定量PCR檢測 按照試劑盒操作說明提取腫瘤石蠟組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:dNTP 1 μL,RNA 2 μL，DEPC-H2O 4 μL，引物0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，Buffer 2 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。上機(jī)進(jìn)行檢測。定量PCR反應(yīng)體系5 μL,包括Master Mix 2.5 μL，模板cDNA 1 μL,上下游引物各為0.25 μL,H2O 1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，69 ℃ 2 min，共40個循環(huán)；最后69 ℃ 8 min。利用軟件分析其Ct值，計算TUBB3與β-actin的相對表達(dá)值。

1.4 隨訪資料的收集

隨訪方式包括:電話隨訪、定期復(fù)查。隨訪時間為手術(shù)當(dāng)天到死亡或末次隨訪時間，截至2013年8月31日。療效評估和觀察指標(biāo)如下。①無瘤生存期(DFS)：為手術(shù)后至病人疾病復(fù)發(fā)或死亡時間。②總生存期(OS)：為手術(shù)后至病人死亡時間或最后1次隨訪的日期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存分析比較采用Log-rank檢驗，預(yù)后多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型，具體賦值為：性別(1=男性，0=女性)，年齡(1=≤65歲，0=>65歲)，病理類型(1=鱗癌，2=腺癌，3=其他)，分化程度(1=高分化，2=中分化，3=低分化)；TNM分期(1=ⅡA期，2=ⅡB期，3=ⅢA期)，TUBB3 mRNA表達(dá)水平(1=低表達(dá)，0=高表達(dá))，用逐步回歸法進(jìn)行分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 TUBB3 mRNA表達(dá)與病人臨床特征的關(guān)系

本文88例病人TUBB3 mRNA表達(dá)中位值為0.269 8(0.001 6～1.866 1)，以各基因表達(dá)中位值為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。TUBB3 mRNA表達(dá)與病人性別、年齡、腫瘤病理類型、腫瘤病理分期、腫瘤分化程度均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 TUBB3 mRNA表達(dá)與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.2 TUBB3 mRNA表達(dá)與術(shù)后輔助化療療效和預(yù)后的關(guān)系

TUBB3 mRNA低表達(dá)者中位DFS為37個月，高表達(dá)者中位DFS為23個月，差異無顯著性(P>0.05)；TUBB3 mRNA低表達(dá)者中位OS為51個月，高表達(dá)者中位OS為32個月，差異有顯著性(χ2=5.205，P<0.05)。單因素分析顯示，TUBB3 mRNA表達(dá)水平、分化程度、TNM分期是影響Ⅱ～ⅢA期NSCLC病人OS的危險因子。將單因素分析有顯著性因子納入Cox回歸模型行多因素分析顯示，TUBB3 mRNA表達(dá)水平(RR=0.453，95%CI:0.267～0.768，P<0.05)、TNM分期(RR=1.629，95%CI:1.158～2.293；P<0.05)為病人獨(dú)立不良預(yù)后因素。

3 討 論

NSCLC主要包括腺癌和鱗癌，約占全部肺癌的80%，其術(shù)后5年生存率僅30%左右[2]。目前對于Ⅱ～ⅢA期的NSCLC病人，在根治性切除術(shù)后接受鉑類聯(lián)合三代抗腫瘤新藥(紫杉醇、長春瑞濱、吉西他濱)的輔助化療已成為標(biāo)準(zhǔn)治療模式。一項權(quán)威的關(guān)于肺癌輔助化療的Meta分析顯示，手術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的輔助化療較單純手術(shù)治療更有助于提高病人的總生存率[3]。但是因為化療藥物的毒副作用及耐藥性，NSCLC完全切除術(shù)后輔助化療的療效欠佳。目前，肺癌的規(guī)范化治療方案是以病理類型、臨床分期為依據(jù)，以大型臨床試驗的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，重點考慮的是相同臨床特征病人群體的治療策略，缺乏個體化治療方法的思考，其結(jié)果并未給大多數(shù)肺癌病人的預(yù)后帶來實質(zhì)性的改變。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，肺癌個體化基因表達(dá)與病人化療藥物療效及預(yù)后的關(guān)系越來越受到廣大研究者的重視。分子標(biāo)志物預(yù)測預(yù)后和指導(dǎo)治療已成為一種新的治療模式。

抗微管類化療藥物是作用于細(xì)胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂的一類廣譜化療藥物。研究顯示，TUBB3 mRNA表達(dá)水平與抗微管類化療藥物的療效及耐藥性相關(guān)，尤其是接受了紫杉醇或者長春瑞濱治療的病人。GAN等[4]采用siRNA技術(shù)將NSCLC細(xì)胞株NCI-H460和細(xì)胞株Calu-6的TUBB3表達(dá)降低，從而使這兩種肺癌細(xì)胞株對長春瑞濱的敏感性明顯提高。然而，TUBB3在NSCLC術(shù)后輔助化療中作用，目前研究結(jié)果不一。REIMAN等[5]研究結(jié)果表明，TUBB3高表達(dá)是一個不良的預(yù)后因素，TUBB3低表達(dá)能從NSCLC輔助化療中獲益。ZHANG等[6]研究顯示，對于完全切除術(shù)后接受輔助化療的NSCLC病人來說，TUBB3陽性病人的中位OS明顯小于陰性病人，TUBB3是一個重要的預(yù)后因子。但是也有學(xué)者得出不同的結(jié)果，SEVE等[7]研究結(jié)果顯示，在接受術(shù)后長春瑞賓及順鉑輔助化療的病人中，TUBB3高表達(dá)的病人，其DFS和OS均長于低表達(dá)的病人。ZHANG等[8]采用免疫組織化學(xué)方法檢測了85例手術(shù)切除NSCLC病人腫瘤組織，所有病人術(shù)后接受長春瑞濱并順鉑或長春瑞濱并卡鉑化療，TUBB3陽性表達(dá)者相對于陰性表達(dá)者，有更長DFS，OS也有延長的趨勢，Cox多因素分析結(jié)果顯示，病理分期和TUBB3陽性表達(dá)是影響DFS獨(dú)立預(yù)測因素。

本研究因選取的88例NSCLC病人均行根治性手術(shù)，術(shù)后沒有可觀察的病灶，我們以生存時間來推測化療效果。研究結(jié)果顯示， TUBB3 mRNA低表達(dá)者OS長于高表達(dá)者，差異有顯著意義；與高表達(dá)者相比有DFS延長的趨勢，雖然差異無顯著意義，但不排除由于入組病例偏少所致；Cox多因素分析顯示，TUBB3 mRNA高表達(dá)、腫瘤TNM分期是獨(dú)立的不良預(yù)后因素。說明TUBB3 mRNA表達(dá)與NP方案輔助化療的療效有關(guān)，TUBB3 mRNA低表達(dá)病人接受長春瑞濱化療的效果較好，生存時間長，TUBB3 mRNA高表達(dá)病人預(yù)后差，不宜接受長春瑞濱化療，可選用其他化療藥物。

綜上所述，NSCLC病人TUBB3 mRNA表達(dá)可以指導(dǎo)化療藥物的應(yīng)用。通過基因檢測，選擇最適合的輔助化療方案，達(dá)到療效的最大化和副作用的最小化，將是未來治療腫瘤的一種趨勢。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ZHANG H L, RUAN L, ZHENG L M, et al. Association between class Ⅲ β-tubulin expression and response to paclitaxel/vinorebine-based chemotherapy for non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. Lung Cancer, 2012,77(1):9-15.

[2] 金翔鳳,羅宜人,王明釗,等. 非小細(xì)胞肺癌病人外周血MUC1基因定量表達(dá)及意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2010,25(1):8-9,12.

[3] PIGNON J P, TRIBODET H, SCAGLIOTTI G V, et al. Lung adjuvant cisplatin evaluation: a pooled analysis by the LACE Collaborative Group[J]. Clin Oncol, 2008,26(21):3552-3559.

[4] GAN P P, PASQUIER E, KAVALLARIS M. Class Ⅲ beta-tubulin mediates sensitivity to chemotherapeutic drugs in non small cell lung cancer[J]. Cancer Res, 2007,67(19):9356-9363.

[5] REIMAN T, LAI R, VEILLARD A S, et al. Cross-validation study of class Ⅲ beta-tubulin as a predictive marker for benefit from adjuvant chemotherapy in resected non-small-cell lung cancer: analysis of four randomized trials[J]. Ann Oncol, 2012,23(1):86-93.

[6] ZHANG S, LI Q, ZHANG Q, et al. Expression of ERCC1 and class Ⅲ β-tubulin in resected non-small cell lung cancer and its correlation with platinum-based adjuvant chemotherapy[J]. Int J Biol Markers, 2010,25(3):141-149.

[7] SEVE P, LAI R, DING K, et al. Class Ⅲ beta-tubulin expression and benefit from adjuvant cisplatin/vinorelbine che-motherapy in operable non-small cell lung cancer: analysis of NCIC JBR.10[J]. Clin Cancer Res, 2007,13(3):994-999.

[8] ZHANG Y, YANG H, LIU J, et al. High expression levels of class Ⅲ β-tubulin in resected non-small cell lung cancer patients are predictive of improved patient survival after vinorelbine-based adjuvant chemotherapy[J]. Oncol Lett, 2013,6(1):220-226.