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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 腫瘤科； 2 中心實(shí)驗(yàn)室)

乏氧是實(shí)體腫瘤中一種常見(jiàn)現(xiàn)象，腫瘤微環(huán)境中都存在不同程度的乏氧。乏氧可以使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一系列基因發(fā)生變化，從而使相應(yīng)基因所在的傳導(dǎo)通路的上游基因發(fā)生變化，這些基因的產(chǎn)物引起乏氧腫瘤細(xì)胞的一系列生物學(xué)行為改變。乏氧時(shí)腫瘤細(xì)胞在適應(yīng)乏氧微環(huán)境的同時(shí)，又與腫瘤放化療抵抗、惡性進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]，低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α) 為其中關(guān)鍵作用因子，與放化療抗拒、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等均有密切關(guān)聯(lián)[2]。p53基因是一種常見(jiàn)的抑癌基因，乏氧和DNA損傷可以導(dǎo)致p53表達(dá)增多，且HIF-1α與p53的關(guān)系密切[3]。小劑量電離輻射可以產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)[4]，但這種效應(yīng)機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察小劑量和大劑量X線(xiàn)照射后SKOV3裸鼠移植瘤內(nèi)HIF-1α和p53表達(dá)情況的差異，探討小劑量輻射產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

卵巢上皮性癌細(xì)胞株SKOV3，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。BALB/C雌性裸鼠，4～5周齡，體質(zhì)量10～13 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。Trizol RNA提取試劑，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TAKARA PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；兔HIF-1α單抗，購(gòu)自Abcam香港有限公司；HIF-1α、p53引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP) 試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，均購(gòu)自北京中山生物金橋技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1移植瘤動(dòng)物模型建立 SKOV3卵巢癌細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)0.10新生小牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×1011/L，于裸鼠右側(cè)股內(nèi)側(cè)皮下接種6×107個(gè)SKOV3細(xì)胞，接種后待移植瘤長(zhǎng)至最大直徑2 cm。

1.2.2動(dòng)物分組及照射 將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(A組)、小劑量照射組(B組)、大劑量照射組(C組)和聯(lián)合照射組(小劑量誘導(dǎo)+大劑量照射，D組)，每組6只。A組不做任何處理，其余各組均采用劑量率為3.0 Gy/min的瓦里安23-EX直線(xiàn)加速器、 6 MV的X射線(xiàn)進(jìn)行腫瘤局部單次照射，B組照射劑量為0.5 Gy;C組照射劑量為3.0 Gy;D組先照射0.5 Gy，24 h后再照射3.0 Gy。

1.2.3腫瘤標(biāo)本采集及處理 各組裸鼠分別于照射后48 h采用脫頸法處死，立即取完整腫瘤標(biāo)本，切取部分腫瘤組織置40 g/L中性甲醛固定液中固定6～18 h，標(biāo)本脫水后石蠟包埋備用。剩余腫瘤標(biāo)本于-80 ℃液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4腫瘤標(biāo)本總RNA的提取 將超低溫冷凍的腫瘤組織用電子天平稱(chēng)取100 mg，用剪刀冰上剪成小碎塊后放入新的EP管(1.5 mL)中，按照Trizol RNA提取說(shuō)明書(shū)的步驟提取RNA，放入-70 ℃冰箱中保存。

1.2.5引物設(shè)計(jì)及其合成 檢索NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得目的基因(HIF-1α、p53)及內(nèi)參基因(GAPDH)的全長(zhǎng)序列，利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)目的基因及內(nèi)參基因的引物序列，擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.2.6半定量RT-PCR 將提取的4組RNA在紫外線(xiàn)分光光度儀上測(cè)定A260/A280比值，并調(diào)整各組的濃度相一致。按照TAKARA PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別進(jìn)行HIF-1α和p53基因的RT-PCR。

表1 HIF-1α、p53及其內(nèi)參基因GAPDH的引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.7PCR產(chǎn)物測(cè)定及圖像分析 取PCR產(chǎn)物5 μL,以DNA Marker作為PCR片段大小指示劑，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳20 min，在紫外線(xiàn)燈下觀察PCR擴(kuò)增的特異產(chǎn)物。經(jīng)凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分掃描，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算HIF-1α、p53積分吸光度比值進(jìn)行定量分析。

1.2.8免疫組化染色檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá) 取經(jīng)中性甲醛固定液固定的腫瘤標(biāo)本切片，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)。每只小鼠取1張切片，每組共取6張切片，以PBS作陰性對(duì)照, HIF-1α陽(yáng)性的宮頸癌手術(shù)標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照。隨機(jī)選擇4個(gè)高倍視野(400倍)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及著色強(qiáng)度判定結(jié)果。染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)染色為 0，弱染色(淺黃色)為 1，中等染色(棕黃色)為 2，強(qiáng)染色(黃褐色)為 3。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分為5個(gè)等級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量<5%為0，陽(yáng)性細(xì)胞5%～24%為1，陽(yáng)性細(xì)胞25%～49%為2，陽(yáng)性細(xì)胞50%～74% 為3，陽(yáng)性細(xì)胞75%～100%為4。細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例的計(jì)分平均數(shù)相乘從而得到加權(quán)得分，加權(quán)得分0～3為陰性(-)；4～6為(+)；7～9為()；10～12為()。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組腫瘤組織HIF-1α mRNA表達(dá)比較

各組腫瘤組織中HIF-1α mRNA均有一定量的表達(dá)(圖1)，4組間相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=116.897,P<0.05)。其中，與A組相比較，B組HIF-1α mRNA表達(dá)明顯下降，C組明顯升高，差異有顯著性(t=10.14、8.78，P<0.05)；A、D兩組比較HIF-1α mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著意義(t=1.84，P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 各組腫瘤組織p53 mRNA表達(dá)比較

各組腫瘤組織中p53 mRNA表達(dá)比較，差異有顯著性(F=353.794，P<0.05)。其中，與A組比較，B組p53 mRNA表達(dá)明顯下降，C組明顯升高，差異有顯著性(t=8.84、22.36，P<0.05)；A、D兩組間p53 mRNA表達(dá)比較差異無(wú)顯著意義(t=1.28，P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖1 各組腫瘤組織HIF-1α瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 各組腫瘤組織中HIF-1α mRNA和p53 mRNA表達(dá)比較

2.3 各組腫瘤組織HIF-1α蛋白表達(dá)

圖2 各組腫瘤組織p53瓊脂糖凝膠電泳圖

A：對(duì)照組；B：小劑量照射組；C：大劑量照射組；D：聯(lián)合照射組。伊紅-蘇木精染色，400倍。

3 討 論

乏氧是影響腫瘤放射治療敏感性的重要因素。電離輻射對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物效應(yīng)需要氧的存在。在有氧存在的情況下，氧與電離輻射產(chǎn)生的自由基形成有機(jī)過(guò)氧基，電離輻射引起的DNA損傷被有機(jī)過(guò)氧基化學(xué)固定下來(lái)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。實(shí)體瘤中很多區(qū)域的血供不能滿(mǎn)足腫瘤生長(zhǎng)的需要，這些區(qū)域腫瘤細(xì)胞因供氧不足而營(yíng)養(yǎng)不良，被稱(chēng)為乏氧細(xì)胞。乏氧細(xì)胞對(duì)電離輻射抗拒，導(dǎo)致放療后實(shí)體瘤腫瘤細(xì)胞殘存，增加了腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，如何在放射治療過(guò)程中盡可能減少乏氧細(xì)胞的數(shù)量，改善實(shí)體瘤的乏氧情況，成為了一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

目前，測(cè)定實(shí)體瘤乏氧程度的方法有很多，如氧敏感微電極法[6]、DNA彗星分析法[7]、腫瘤細(xì)胞乏氧生物學(xué)指標(biāo)法[8]等。本文采用免疫組化方法，檢測(cè)常用乏氧生物學(xué)指標(biāo)HIF-1α在SKOV3裸鼠移植瘤組織的表達(dá)情況，以判定腫瘤組織的乏氧情況。已有研究結(jié)果顯示，常規(guī)電離輻射可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)，并使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞釋放的NO與HIF-1α蛋白發(fā)生S-亞硝基化，從而使HIF-1α穩(wěn)定性明顯增加，導(dǎo)致腫瘤血管生成，對(duì)放化療抗拒和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[9]。小劑量電離輻射是否可以通過(guò)改善實(shí)體瘤的乏氧情況而增加常規(guī)誘導(dǎo)的效果研究較少。本文結(jié)果表明，小劑量電離輻射可以降低腫瘤組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)，即可以改善乏氧；小劑量誘導(dǎo)加大劑量照射與直接大劑量照射相比，前者腫瘤組織乏氧程度較輕，表明小劑量照射可以改善實(shí)體瘤的乏氧情況，增強(qiáng)腫瘤組織的放射敏感性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，小劑量照射可以降低HIF-1α及p53 mRNA的表達(dá)水平，小劑量誘導(dǎo)加大劑量照射組腫瘤組織中兩者的表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，而單純大劑量照射組腫瘤組織中兩者表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高。HIF-1α mRNA表達(dá)增加可以使放療抵抗、血管生成增多，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率增加[10]。因此，小劑量照射可通過(guò)降低HIF-1α mRNA表達(dá)，減少腫瘤的血管形成，使病人有更好的預(yù)后。多項(xiàng)研究顯示，乏氧與DNA損傷可以上調(diào)p53 mRNA的表達(dá)，但低氧不引起野生型p53基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，在低氧區(qū)域，p53野生型腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，這導(dǎo)致了突變型p53腫瘤細(xì)胞的殘存和擴(kuò)增，這些細(xì)胞具有更高的凋亡閾值及乏氧耐受能力[11]，這導(dǎo)致腫瘤放射敏感性降低，預(yù)后變差。本文結(jié)果顯示，大劑量組p53 mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高，表明突變型p53基因轉(zhuǎn)錄增加，導(dǎo)致腫瘤放射敏感性降低，腫瘤侵襲程度增加，腫瘤出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；而小劑量誘導(dǎo)加大劑量照射組p53 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，可能與小劑量誘導(dǎo)加大劑量照射組的乏氧程度較大劑量照射組輕有關(guān)。

綜上所述，腫瘤病人接受大劑量放療前1 d先進(jìn)行小劑量的誘導(dǎo)照射，可顯著降低腫瘤組織的乏氧狀況，降低HIF-1α與p53 mRNA的表達(dá)水平，從而增加放療敏感性，減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。探討其可能機(jī)制，可為改善臨床放射治療模式，提高放射敏感性，降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)等提供更好的理論基礎(chǔ)和方案。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李發(fā)紅,紀(jì)新強(qiáng),吳景麗. 子宮內(nèi)膜癌組織APE,HIF-1α和VEGF表達(dá)及意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2010,25(2):101-103.

[2] 楊曉菊,戴淑真,楊宗利,等. 妊娠期糖尿病胎盤(pán)組織中 HIF-1α 的表達(dá)及意義[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013,49(1):22-24.

[3] SENDOEL A, KOHLER I, FELLMANN C, et al. HIF-1 antagonizes p53-mediated apoptosis through a secreted neuronal tyrosinase[J]. Nature, 2010,465(7298):577-583.

[4] YU H S, SONG A Q, LU Y D, et al. Effects of low-dose radiation on tumor growth, erythrocyte immune function and SOD activity in tumor-bearing mice[J]. Clin Med J, 2004,117(7):1036-1039.

[5] 殷蔚伯. 腫瘤放射治療學(xué)[M]. 4版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 2008:263-265.

[6] DOLL C M, MILO SEVICM, PINTILIE M, et al. Estimating hypoxic status in human tumors: a simulation using eppendorf oxygen probe datain cervical cancer patients[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2003,55(5):1239-1246.

[7] LE Q T, KOVACS M S, DORIC M J, et al. Comparison of comet assay and oxygen microelect rode for measuring tumor oxygenation in head and neck cancer patients[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2003,56(2):375-383.

[8] HAUGLAND H K, VUKOUC V, PINTILIEM, et al. Expression of hypoxia inducible factor 1α in cervical carcinomas: correlation with tumor oxygenation[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2002,53:854-861.

[9] HARADA H, ITASAKA S, ZHU Y, et al. Treatment regimen determines whether an HIF-1 inhibitor enhances or inhi-bits the effect of radiation therapy[J]. British journal of cancer, 2009,100(5):747-757.

[10] ZHENG Y, NI Y, HUANG X, et al. Overexpression of HIF-1α indicates a poor prognosis in tongue carcinoma and may be associated with tumour metastasis[J]. Oncol Lett, 2013,5(4):1285-1289.

[11] MULLER P A J, CASWELL P T, DOYLE B, et al. Mutant p53 drives invasion by promoting integrin recycling[J]. Cell, 2009,139(7):1327-1341.