王 健，吉健華，全 瑛，王醫(yī)林，趙花妮

(西安市第五醫(yī)院風濕科，陜西西安710000)

風濕性心臟病心肌細胞生成的膠原蛋白與心肌纖維化關系緊密，而轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)又在風濕性心臟病纖維化過程中發(fā)揮著重要作用［1］。槲皮素是一種具有多種生物學功能的多羥基黃酮類化合物，但是槲皮素對風濕性心臟病的作用不明。體外培養(yǎng)的風濕性心肌細胞，觀察槲皮素對風心病是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料:西安交通大學第一附屬醫(yī)院提供左室乳頭肌(瓣膜置換術的風濕性心臟病患者，研究獲得西安交通大學倫理委員會審查批準書及受試者簽署知情同意書);TGF-β1(Roche applied science);槲皮素來自北京化工廠產品。

1.2 方法:1)風心病患者心肌細胞培養(yǎng)及干預，左室乳頭肌行細胞分離與原代培養(yǎng)。加入TGF-β1:0、2.5、5和10μg/L，孵育48 h，觀察膠原蛋白合成變化。5μg/L TGF-β1干預基礎上，加入 0、25、50和 100μmol/L槲皮素，觀察其對TGF-β1促膠原蛋白生成影響。2)RT-PCR檢測前膠原基因表達:提取細胞總 RNA，測定濃度。將0.5μg RNA合成cDNA，以GAPDH為參照基因來擴增Ⅰ型前膠原基因。PCR反應體系為25μL，反應條件為:95℃條件下變性2 min，于94 ℃，30 s，60℃，1 min，68℃，2 min條件來擴增35個循環(huán)，最后于68℃條件下延伸7 min。10μL PCR產物經2%瓊脂糖電泳，經EB染色，以目的基因/內對照基因吸光度比值的均值±標準差(±s)表示檢測目的基因表達。3)Western蛋白印跡30μg總蛋白行凝膠電泳，電轉移至PVDF膜。一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1 h。條帶用薄層掃描儀掃描，軟件分析各條帶吸光度值，計算1型膠原蛋白相對含量。

2 結果

2.1 TGF-β1促進風濕性心臟病心肌細胞膠原蛋白合成

表1 TGF-β1促進風濕性心肌細胞1型膠原蛋白生成Table 1 TGF-β1 increased the generation of type Ⅰcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

表1 TGF-β1促進風濕性心肌細胞1型膠原蛋白生成Table 1 TGF-β1 increased the generation of type Ⅰcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 2.5μg/L;ΔP ＜0.05 compared with 5 μg/L．

group typeⅠcollagen mRNA typeⅠcollagen protein control 0.41±0.08 1.16±0.06 TGF-β1(μg/L) 2.5 0.62 ±0.06* 1.65 ±0.11*5 0.86±0.11# 2.08±0.13#10 1.12±0.09Δ 2.85±0.22Δ

2.2 槲皮素抑制TGF-β1對風濕性心臟病心肌細胞膠原蛋白合成誘導作用

表2 槲皮素降低TGF-β1對風濕性心肌細胞1型膠原的促生成作用Table 2 Quercetol inhibited TGF-β1-induced generation of typeⅠcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

表2 槲皮素降低TGF-β1對風濕性心肌細胞1型膠原的促生成作用Table 2 Quercetol inhibited TGF-β1-induced generation of typeⅠcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 25μmol/L;ΔP ＜0.05 compared with 50 μmol/L．

groups typeⅠcollagen mRNA typeⅠcollagen protein control 0.89±0.10 2.13±0.12 quercetol(μmol/L)25 0.60±0.09* 1.85±0.13*50 0.43±0.07# 1.43±0.10#100 0.30±0.05Δ 1.10±0.09Δ

3 討論

風濕性心臟病主要病理變化就是異常膠原成分沉積所致心肌纖維化，而被增生纖維包繞的心肌細胞發(fā)生萎縮，并可伴有空泡樣變［2］，因此抑制纖維化發(fā)展將有益于風濕性心臟病患者。

風濕性心臟病心肌纖維化時心肌細胞均參與了膠原蛋白的合成。TGF-β1可通過自分泌調控方式影響心肌細胞膠原蛋白生成。通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠劑量依賴性地增加風濕性心肌細胞I型膠原蛋白合成(表1)，這與以往研究結論是一致的，也為我們后續(xù)實驗提供了基礎。設法降低TGF-β1激活、釋放或拮抗其對膠原合成作用，有可能為防治風心病心肌纖維化提供新的手段。槲皮素能夠發(fā)揮多種生物學功能，具備抗氧化、抗癌、抗感染、降糖降壓及免疫調節(jié)等作用［3］，但是其對風濕性心臟病作用研究較少。我們給與培養(yǎng)的心肌細胞5μg/L TGF-β1預處理，然后以此給與不同濃度的槲皮素。結果我們發(fā)現(xiàn)，槲皮素劑量依賴性地抑制了TGF-β1的促I型膠原蛋白生成作用(表2)。這些發(fā)現(xiàn)為風濕性心臟病防治提供了理論基礎。

［1］Luo F，Zhuang Y，Sides MD，etal．Arsenic trioxide inhibits transforming growth factor-beta1-induced fibroblast to myofibroblast differentiation in vitro and bleomycin induced lung fibrosis in vivo［J］．Respir Res，2014，15:51．

［2］張近寶，劉維永，晏培松，等．風濕性心臟病心肌中增殖細胞核抗原和A2平滑肌肌動蛋白的表達與心功能關系［J］．中華心血管病雜志，1998;26:274-277．

［3］王曉慶，梁中琴，顧振綸，等．槲皮素抑制血管生成作用的實驗研究［J］．中國藥理學通報，2004，20:1161-1164．